異種脫細(xì)胞肌腱鼻充填材料的生物相容性研究.pdf

1、研究背景
　　 臨床上因各種原因所造成的軟組織缺損的修復(fù)是整形外科面對的主要問題之一。軟組織缺損所致的凹陷畸形可能影響患者的容貌甚至功能活動，并進(jìn)而影響其心理健康和生活質(zhì)量。缺損所致的凹陷畸形必須采用組織或材料充填來修復(fù)，目前臨床上常用的方法主要有自體組織的外科移植和注射移植、人工材料植入和注射充填等，但這些方法均不同程度地存在一些問題。如自體組織移植包括自體脂肪、軟骨、筋膜等，都需要從患者自身切取，會造成新的創(chuàng)傷與瘢痕，且植入

2、組織不穩(wěn)定，脂肪易液化吸收，軟骨可能變形甚至被吸收，筋膜易發(fā)生纖維化且質(zhì)地較軟，在不同程度上給患者增加痛苦并可能造成繼發(fā)畸形，因此自體組織移植都存在一定的局限性。人工充填材料植入可能并發(fā)感染、排異反應(yīng)、對組織細(xì)胞的刺激以及植入體所引起的纖維囊和炎性肉芽組織增生等，這些缺點(diǎn)使之不盡人意。而組織工程修復(fù)軟組織缺損，目前還處于研究階段，無論是基礎(chǔ)研究還是臨床應(yīng)用都存在諸多問題，短期內(nèi)難有突破性進(jìn)展。因此研究開發(fā)生物相容性好、來源豐富、安全有效

3、的充填材料，一直是整形外科的研究熱點(diǎn)。
　　 近年來脫細(xì)胞基質(zhì)材料的研究進(jìn)展為組織充填材料的研發(fā)指明了前景。脫細(xì)胞基質(zhì)材料因其結(jié)構(gòu)與人體組織相似，與細(xì)胞親和性強(qiáng)，能為細(xì)胞分化、增殖、生長及功能發(fā)揮提供近似體內(nèi)組織發(fā)生發(fā)育的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)支架條件，加之其來源豐富，故逐漸被應(yīng)用到再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。采用各種脫細(xì)胞技術(shù)處理的異種基質(zhì)材料，如膀胱、輸尿管、骨組織、心瓣膜、硬腦膜以及脫細(xì)胞真皮等，經(jīng)動物實(shí)驗(yàn)研究和臨床試驗(yàn)證實(shí)具有良好的組織

4、相容性。臨床上，脫細(xì)胞真皮材料有多種產(chǎn)品已被批準(zhǔn)應(yīng)用，但脫細(xì)胞真皮材料因其質(zhì)地、厚度和體積的限制，針對特定的組織充填如隆鼻、隆下頜等仍不能完全滿足要求，臨床應(yīng)用有一定的局限性。目前在整形外科領(lǐng)域，還鮮有關(guān)于脫細(xì)胞肌腱的研究報告，動物組織肌腱組成主要是Ⅰ、Ⅲ型膠原，其組成與軟骨相似，且肌腱組織更容易成形并具有一定的厚度，因此可成為理想的材料來源，脫細(xì)胞肌腱相對于脫細(xì)胞真皮的優(yōu)點(diǎn)，使其在軟組織缺損的充填修復(fù)方面具有廣闊的應(yīng)用潛力。
　

5、　 本研究前期與再生型醫(yī)用植入器械國家工程實(shí)驗(yàn)室（廣東冠昊生物科技股份有限公司承擔(dān)）合作，完成了異種脫細(xì)胞肌腱材料的制作、生物學(xué)性能檢測和生物相容性初步研究。一、采用同種環(huán)氧化物交聯(lián)處理技術(shù)，應(yīng)用組織固定、去抗原等系列專利技術(shù)，將豬的肌腱制備成異種脫細(xì)胞肌腱。該脫細(xì)胞肌腱材料保留了肌腱固有的三維結(jié)構(gòu)及良好的生物力學(xué)特性。且此種環(huán)氧化物可與蛋白質(zhì)分子形成穩(wěn)定的交聯(lián)鍵，大大提高材料的穩(wěn)定性，無殘留毒性，使被處理的異種材料不僅穩(wěn)定性好，不引

6、起免疫排異反應(yīng)，還能誘導(dǎo)機(jī)體組織向其中生長，并和機(jī)體組織融為一體。二、經(jīng)過對制備的異種脫細(xì)胞肌腱材料的形態(tài)學(xué)（包括光鏡及掃描電鏡）觀察、力學(xué)性能檢測、化學(xué)穩(wěn)定性進(jìn)行檢測，結(jié)果表明:(1)異種脫細(xì)胞肌腱材料為纖維條束樣結(jié)構(gòu)，脫細(xì)胞完全，未見細(xì)胞成份。(2)材料力學(xué)性能優(yōu)良，符合醫(yī)用生物材料的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。(3)材料組成單一，具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性，無環(huán)氧化物及重金屬殘留。三、將異種脫細(xì)胞肌腱埋植于實(shí)驗(yàn)犬背部脊柱兩側(cè)皮下軟組織內(nèi)，未出現(xiàn)感染、壞死

7、等異常反應(yīng)。
　　 本研究擬在前期研究基礎(chǔ)上，將豬脫細(xì)胞肌腱經(jīng)生物工藝加工成“L”形鼻充填材料，對其微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究觀察;通過體外急性毒性試驗(yàn)、致敏試驗(yàn)、皮內(nèi)刺激實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞毒性試驗(yàn)和動物（犬）鼻部植入實(shí)驗(yàn)，研究該材料的生物相容性和生物安全性;通過臨床試驗(yàn)，觀察驗(yàn)證人體鼻部植入異種脫細(xì)胞肌腱材料后的生物相容性和臨床實(shí)用性。通過上述研究觀察為研發(fā)異種脫細(xì)胞肌腱鼻充填材料提供依據(jù)。
　　 研究方法
　　 一、異種脫細(xì)胞

8、肌腱(XAT)鼻充填材料體外生物相容性研究
　　 參照醫(yī)療器械生物學(xué)評價標(biāo)準(zhǔn)和要求，采用標(biāo)準(zhǔn)的毒理學(xué)方法進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)、致敏試驗(yàn)、皮內(nèi)刺激實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞毒性試驗(yàn)，對制備的異種脫細(xì)胞肌腱(XAT)鼻充填材料進(jìn)行系統(tǒng)的體外生物相容性及生物安全性評價。
　　 異種脫細(xì)胞肌腱（XAT）鼻充填材料掃描電鏡檢測(SEM):取制備的異種脫細(xì)胞肌腱充填材料的切片，2.5％((V)/(V))戊二醛4℃固定24h,經(jīng)30％-100％梯度乙醇脫

9、水、醋酸異戊酯浸泡30min、等電點(diǎn)干燥。干燥后的樣品表面噴鉑金，SEM觀察異種脫細(xì)胞肌腱鼻充填材料的微觀結(jié)構(gòu)。
　　 二、異種脫細(xì)胞肌腱(XAT)鼻充填材料體內(nèi)生物相容性研究
　　 將XAT與硅膠分別植入24只狗（XAT組n=12只;硅膠組n=12只）鼻背骨膜下，于埋植后2周、1月、3月、12月（XAT組n=3只/時間點(diǎn);硅膠組n=3只/時間點(diǎn)）取材行HE染色，采用半定量法比較兩種材料的包膜反應(yīng)、炎癥反應(yīng)及間質(zhì)反應(yīng)程度

10、來評價XAT體內(nèi)生物相容性。
　　 異種脫細(xì)胞肌腱（XAT）鼻充填材料免疫組化染色:通過免疫組化染色，研究XAT組織塊周圍基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)表達(dá)情況，對其在體內(nèi)轉(zhuǎn)歸做初步研究。
　　 三、異種脫細(xì)胞肌腱(XAT)鼻充填材料臨床試驗(yàn)
　　 征集志愿者，應(yīng)用“L”形異種脫細(xì)胞肌腱(XAT)鼻充填材料和對照組用硅膠鼻假體，進(jìn)行隆鼻臨床試驗(yàn)，采用前瞻性、隨機(jī)單盲、平行對照、非劣效臨床研究，觀察其臨床效果。試證

11、實(shí)異種脫細(xì)胞肌腱材料作為鼻部充填材料應(yīng)用于鼻部修復(fù)整形中的安全性、有效性以及臨床實(shí)用性。
　　 四、統(tǒng)計方法
　　 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，XAT組及硅膠組間比較采用兩獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以M(andrange)表示，P值＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果
　　 一、異種脫細(xì)胞肌腱(XAT)鼻充填材料體外生物相容性研究
　　 急性毒性實(shí)驗(yàn):各組小鼠活

12、動正常，72h小鼠無死亡，各組動物未見中毒癥狀或不良反應(yīng)。致敏試驗(yàn)顯示材料組和陰性對照組的皮膚反應(yīng)指數(shù)均為0，無致敏性。皮內(nèi)刺激實(shí)驗(yàn)觀察顯示，材料浸提液和生理鹽水處無明顯紅斑、水腫和皮膚壞死，極輕微刺激。材料的細(xì)胞毒性結(jié)果示該材料的相對增殖度較高，細(xì)胞毒性分級在0-1級。
　　 異種脫細(xì)胞肌腱(XAT)鼻充填材料掃描電鏡檢測(SEM):XAT結(jié)構(gòu)完整，膠原纖維縱行平行排列，未見斷裂，纖維間存在大量裂隙，表面可見棉絮樣附著物，未見

13、細(xì)胞及其殘核存留。橫截面可見腱內(nèi)膜分隔并包繞膠原纖維形成肌腱束，結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)部未有細(xì)胞殘留。
　　 二、異種脫細(xì)胞肌腱(XAT)鼻充填材料體內(nèi)生物相容性研究
　　 埋植后2周，XAT組與硅膠組均有輕度炎癥反應(yīng)及輕微程度纖維組織包裹，炎癥反應(yīng)及包膜反應(yīng)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.841;P=0.638)，XAT組間質(zhì)反應(yīng)輕度，較硅膠組明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.007)。1月、3月，XAT組炎癥反應(yīng)逐漸減弱，包膜反應(yīng)較硅

14、膠組輕，間質(zhì)反應(yīng)增強(qiáng)，至12月XAT組炎癥反應(yīng)輕微，輕度纖維組織包裹，間質(zhì)反應(yīng)輕度，與較硅膠組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.005)。
　　 異種脫細(xì)胞肌腱(XAT)鼻充填材料免疫組化染色:XAT周圍基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)表達(dá)情況:MMP-9在XAT周圍表達(dá)陽性。
　　 三、異種脫細(xì)胞肌腱(XAT)鼻充填材料臨床試驗(yàn)
　　 自2011年7月至12月，應(yīng)用“L”形異種脫細(xì)胞肌腱（XAT）鼻充填材料和對照組用硅

15、膠鼻假體，進(jìn)行隆鼻臨床試驗(yàn)，已完成9例。觀察術(shù)后1周內(nèi)有輕度創(chuàng)傷反應(yīng)，傷口均一期愈合。隨訪最長半年觀察無排斥反應(yīng)、無感染及移植物外露。未發(fā)現(xiàn)假體有收縮或松弛情況，不移動，不變形，鼻部皮膚不變色，形態(tài)自然，未見透亮感。
　　 結(jié)論
　　 異種脫細(xì)胞肌腱充填材料脫細(xì)胞完全，結(jié)構(gòu)完整，理化性能符合國家醫(yī)用生物材料的標(biāo)準(zhǔn)要求，體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)證實(shí)其具有良好的生物相容性和生物安全性，能滿足作為鼻充填材料應(yīng)用于鼻部修復(fù)整形中的生物安全性