牛肌腱膠原的提取及生物相容性的研究.pdf

1、目的： 1、建立一種牛肌腱高效提取膠原蛋白的方法并對提取的膠原蛋白的生物學(xué)性能進行表征檢測。 2、觀察牛肌腱膠原蛋白和鼠尾膠原蛋白構(gòu)建的組織工程皮膚收縮情況。 3、研究不同類型膠原蛋白對角質(zhì)形成細胞粘附的影響，并用原子力顯微鏡觀察膠原與種子細胞粘附的微觀結(jié)構(gòu)。 4、利用天狼猩紅偏振光法檢測復(fù)方殼多糖組織工程皮膚中膠原合成與分泌情況。 方法 1、建立了以酸酶聯(lián)合提取牛肌腱膠原蛋白的方法，并對

2、提取的牛肌腱膠原進行氨基酸含量、熱變性溫度、紅外光譜及其它的一些生物學(xué)性能檢測。 2、新鮮清潔兒童包皮，用酶消化后分離培養(yǎng)角質(zhì)形成細胞和成纖維細胞，用我科已建立的方法，分別采用牛肌腱膠原蛋白和鼠尾膠原蛋白構(gòu)建復(fù)方殼多糖組織工程皮膚，觀察不同類型膠原蛋白構(gòu)建的組織工程皮膚的收縮情況，繪制收縮曲線。 3、分別用牛肌腱膠原、鼠尾膠原和標準Ⅳ型膠原包被培養(yǎng)板，接種相同數(shù)量的原代角質(zhì)細胞，在不同時相用活細胞電子計數(shù)儀測定未粘附細胞

3、的數(shù)量，觀察不同類型膠原所未粘附的細胞數(shù)量的多少，繪制細胞粘附曲線，并用原子力顯微鏡觀察膠原蛋白與細胞的粘附情況。 4、用我科已建立的方法，制備復(fù)方殼多糖組織工程皮膚，然后采用苦味酸一天狼星紅染色，用偏振光顯微鏡觀察，Photoshop半定量分析制備的復(fù)方殼多糖組織工程皮膚中Ⅰ、Ⅲ型膠原的合成和分泌情況。 結(jié)果 1、以牛肌腱為原料，用醋酸及水果蛋白酶的方法，可以高效率的提取膠原蛋白，經(jīng)測定提取的膠原蛋白為Ⅰ型膠原

4、蛋白。 2、用牛肌腱膠原構(gòu)建的組織工程皮膚其收縮度比相同濃度的鼠尾膠原構(gòu)建的組織工程皮膚其收縮度小(P<0.05)。 3、接種1小時以內(nèi)，Ⅳ型膠原對角質(zhì)形成細胞的粘附特性強于牛肌腱膠原和鼠尾膠原，1小時以后，三者粘附差別不明顯，牛肌腱膠原和鼠尾膠原亦無明顯差異。 4、原子力顯微鏡可以清晰的觀察到膠原及膠原與細胞間粘附的微觀結(jié)構(gòu)。 5、正常皮膚和復(fù)方殼多糖組織工程皮膚的真皮中都有Ⅰ、Ⅲ膠原，在正常皮膚的真皮

5、中Ⅰ、Ⅲ膠原含量分別是98.51±11.28、33.93±3.90；培養(yǎng)成熟的復(fù)方殼多糖組織工程皮膚中Ⅰ、Ⅲ膠原含量分別是91.42±3.82、30.75±2.29，兩者相比無明顯差異(P>0.05)。復(fù)方殼多糖組織工程皮膚培養(yǎng)8天、15天、30天，組織內(nèi)Ⅰ型膠原分別為50.75±4.22、63.57±6.87、91.42±3.82，Ⅲ型膠原分別為16.90±1.64、23.65±4.08、30.75±2.29，組間比較有顯著差異(P<

6、0.01)。 結(jié)論 1、酸酶相結(jié)合的方法可以高效率的從牛肌腱中提取膠原蛋白，用提取的牛肌腱膠原構(gòu)建的組織工程皮膚其收縮度比鼠尾膠原構(gòu)建的組織工程皮膚收縮度小，說明用牛肌腱膠原蛋白能顯著降低組織工程皮膚的收縮度，證明組織工程皮膚制造選擇牛肌腱膠原較好，能夠提高產(chǎn)品的性能。 2、牛肌腱膠原和鼠尾膠原與Ⅳ型膠原對角質(zhì)形成細胞的粘附作用無明顯差別，用原子力顯微鏡可以觀察到膠原及膠原與細胞間粘附的微觀結(jié)構(gòu)。 3、培