異種肌腱基質(zhì)材料的生物相容性研究.pdf

1、研究背景：
　　 臨床上因各種因?yàn)樗斐傻能浗M織缺損的修復(fù)是整形修復(fù)外科面對(duì)的主要問(wèn)題之一。軟組織的缺損畸形不僅嚴(yán)重影響患者功能和外觀,而且影響其心理健康和生活質(zhì)量。各種充填材料的應(yīng)用是修復(fù)畸形缺損的有效手段之一,但目前臨床常用的材料都不同程度地存在一些問(wèn)題而不能完全滿足臨床治療的要求。近年來(lái),組織工程與再生醫(yī)學(xué)發(fā)展迅速,特別是再生醫(yī)學(xué)理論為理想的軟組織材料研究指明了前景。再生醫(yī)學(xué)是研究組織器官缺損生理性修復(fù)以及功能重建的新興學(xué)

2、科,其重要的技術(shù)方法即是采用人工生物組織移植并通過(guò)激活局部干細(xì)胞、改變局部微環(huán)境來(lái)誘導(dǎo)組織再生和替代,從而達(dá)到生理性修復(fù)。異種基質(zhì)材料因其結(jié)構(gòu)與人體組織相似,與細(xì)胞親和性強(qiáng),能為細(xì)胞分化、增殖、生長(zhǎng)及功能發(fā)揮提供近似體內(nèi)組織發(fā)生發(fā)育的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)支架條件,加之其來(lái)源豐富,故逐漸被應(yīng)用到再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。采用各種脫細(xì)胞技術(shù)處理的異種基質(zhì)材料,如膀胱、輸尿管、骨組織、心瓣膜、硬腦膜以及脫細(xì)胞真皮等,部分已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段,但在整形外科領(lǐng)

3、域,除針對(duì)皮膚組織缺損的脫細(xì)胞真皮材料基質(zhì)(AlloDerm)外,目前還鮮有其它異種軟組織材料的應(yīng)用研究報(bào)道。
　　 異種材料在制作過(guò)程中需進(jìn)行交聯(lián)處理,以解決生物來(lái)源材料的病菌傳播問(wèn)題,并增強(qiáng)其力學(xué)強(qiáng)度,增進(jìn)其生物穩(wěn)定性并最終解決生物來(lái)源材料的儲(chǔ)存問(wèn)題。同時(shí),通過(guò)交聯(lián)處理保持了生物材料的天然結(jié)構(gòu),使有利于材料與其植入的生物體融合。戊二醛為目前應(yīng)用最廣泛的交聯(lián)劑,雖然能起到組織固定及去抗原雙重功能,但也存在去除抗原不徹底,特別是

4、固定的組織降解物存在醛類,在組織處理過(guò)程中引入了殘留毒性,這不利于細(xì)胞增殖、分化、遷徙以及功能建立。另外,還會(huì)引起宿主一定的體液及細(xì)胞免疫排斥反應(yīng),而且,用戊二醛進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)后材料容易變得僵硬,柔韌性下降,在醫(yī)用時(shí)常引起嚴(yán)重的鈣化?！霸偕歪t(yī)用植入器械國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室”(廣東冠昊生物科技股份有限公司承擔(dān))采用一種高反應(yīng)活性的環(huán)氧化物作為交聯(lián)劑(專利號(hào):US6106555、US6231614B1)解決了這一難題,研究證實(shí)此種環(huán)氧化物可與蛋白

5、質(zhì)分子形成穩(wěn)定的交聯(lián)鍵,大大提高材料的穩(wěn)定性,且無(wú)殘留毒性,使被處理的異種材料不僅穩(wěn)定性好,不引起免疫排異反應(yīng),還能誘導(dǎo)機(jī)體組織向其中生長(zhǎng),并和機(jī)體組織融為一體。采用此環(huán)氧化物交聯(lián)處理研制的異利-腦膜材料已獲得SFDA認(rèn)證,并在臨床廣泛應(yīng)用。以豬的肌腱為原料,采用同一種環(huán)氧化物作為交聯(lián)劑,應(yīng)用組織固定、去抗原等系列專利技術(shù),“再生型醫(yī)用植入器械國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室”研制出了新型異種肌腱基質(zhì)材料(xenogenic tendon matrix

6、materials,XTMM)。本研究擬通過(guò)光鏡、掃描電鏡觀察XTMM的超微結(jié)構(gòu),參照醫(yī)用植入材料的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)XTMM的拉伸強(qiáng)度、扯斷伸長(zhǎng)率、蛋白含量、及重金屬和環(huán)氧化物殘留量進(jìn)行研究,評(píng)價(jià)材料的理化性能,進(jìn)一步通過(guò)急件全身毒性試驗(yàn)、致敏試驗(yàn)、皮內(nèi)刺激試驗(yàn)、細(xì)胞毒性試驗(yàn)和皮下埋植試驗(yàn)研究其安全性、生物相容性和生物學(xué)轉(zhuǎn)歸,探討XTMM的生物學(xué)性能和應(yīng)用機(jī)制,為異種基質(zhì)材料的研究和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　 研究方法
　　 一、X

7、TMM的制備
　　 取新鮮豬肌腱,消毒后首先作預(yù)處理,脫細(xì)胞處理后環(huán)氧交聯(lián)固定,加上采用自主研發(fā)的系列專利技術(shù),包括多方位除抗原技術(shù),蛋白質(zhì)分子修飾技術(shù)等,作進(jìn)一步處理后,裁剪、成形、包裝,鈷60照射滅菌,備用。
　　 二、XTMM的形態(tài)學(xué)觀察
　　 制備的XTMM分別行大體觀察、常規(guī)HE染色后光鏡下觀察材料的超微結(jié)構(gòu)以及掃描電鏡觀察材料的微觀結(jié)構(gòu)。掃描電鏡觀察:取材料的切片,2.5％(V/V)戊二醛4℃固定24

8、 h,經(jīng)30％-100％梯度乙醇脫水、醋酸異戊酯浸泡30 min、等電點(diǎn)干燥。干燥后的樣品表面噴鉑金,掃描電鏡觀察XTMM的微觀結(jié)構(gòu)。
　　 三、XTMM的理化性能檢測(cè)
　　 使用微控電子式拉力試驗(yàn)機(jī)測(cè)量該材料的拉伸強(qiáng)度和拉斷伸長(zhǎng)率等；采用凱氏定氮法粗略測(cè)量材料的總蛋白含量;測(cè)量材料的重金屬含量和環(huán)氧化物殘留量；通過(guò)測(cè)量材料在PBS溶液中的PH值,繪制時(shí)間-pH圖像,研究材料的化學(xué)穩(wěn)定性。
　　 四、XTMM的生

9、物相容性研究
　　 參照醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)和要求,采用標(biāo)準(zhǔn)的毒理學(xué)方法進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)、致敏試驗(yàn)、皮內(nèi)刺激實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞毒性試驗(yàn)和皮下埋植試驗(yàn),對(duì)制備的XTMM進(jìn)行系統(tǒng)的生物相容性及生物安全性評(píng)價(jià)。
　　 五、XTMM的長(zhǎng)期轉(zhuǎn)歸的實(shí)驗(yàn)研究
　　 選用健康成年雜種犬24只,雌雄不限,體重10-13公斤,按實(shí)驗(yàn)后取材時(shí)間不同隨機(jī)分為4組,每組6只,將材料埋置于狗的鼻骨骨膜下,以目前臨床最常用的隆鼻材料硅膠作為對(duì)照,3

10、、6、9、12月定期取材,處死動(dòng)物后取材,H&E染色,光鏡下研究XTMM的生物學(xué)轉(zhuǎn)歸。
　　 六、統(tǒng)計(jì)方法
　　 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,材料的理化性能檢測(cè)采用單樣本t檢驗(yàn),皮下埋植試驗(yàn)采用兩相關(guān)樣本非參數(shù)檢驗(yàn),P值<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果
　　 一、XTMM的形態(tài)學(xué)觀察
　　 材料成均勻的乳白色或淺黃色,表面隱約可見條紋狀天然結(jié)構(gòu),質(zhì)地均

11、一,材料柔韌性尚可,易塑形,易縫合,可按照所需的大小剪裁。HE染色光鏡下見材料為紅染纖維束樣物,可見縫隙,未見細(xì)胞碎屑及藍(lán)染的核物質(zhì),脫細(xì)胞完全。掃描電鏡觀察結(jié)果見走向一致的發(fā)狀纖維樣物緊密縱行平行排列,平直,無(wú)明顯彎曲,分叉不明顯,表面可見棉絮樣物附著,未見細(xì)胞成份。
　　 二、XTMM的理化性能檢測(cè)
　　 材料的拉伸強(qiáng)度為11-16 MPa,拉斷伸長(zhǎng)率為52-67％,均高于標(biāo)準(zhǔn)要求。粗測(cè)XTMM總蛋白含量為94％,證

12、明材料組成較為單一。重金屬含量結(jié)果小于1ug/ml,符合不得高于1 ug/ml的標(biāo)準(zhǔn)要求；環(huán)氧化物的殘留量檢測(cè)結(jié)果為5ug/ml,完全達(dá)到應(yīng)小于10 ug/ml的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。材料化學(xué)穩(wěn)定性檢測(cè)24h pH值連續(xù)監(jiān)測(cè)顯示,XTMM在PBS溶液中的pH值穩(wěn)定,pH值為7.25-7.32。
　　 三、XTMM的生物相容性研究
　　 急性毒性實(shí)驗(yàn):各組小鼠活動(dòng)正常,72 h小鼠無(wú)死亡,各組動(dòng)物未見中毒癥狀或不良反應(yīng)。致敏試驗(yàn)顯示材

13、料組和陰性對(duì)照組的皮膚反應(yīng)指數(shù)均為0,無(wú)致敏性。皮內(nèi)刺激實(shí)驗(yàn)觀察顯示,材料浸提液和生理鹽水處無(wú)明顯紅斑、水腫和皮膚壞死,極輕微刺激。材料的細(xì)胞毒性結(jié)果示該材料的相對(duì)增殖度較高,細(xì)胞毒性分級(jí)在0-1級(jí)。皮下埋植試驗(yàn)顯示各組動(dòng)物術(shù)后生存良好,植入部位均未見組織壞死、積液及化膿感染。組織學(xué)觀察顯示材料在植入14天時(shí)引起輕到中度炎癥反應(yīng),但隨時(shí)間延長(zhǎng)炎癥反應(yīng)逐漸消失。術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)植入材料組與對(duì)照組組織學(xué)評(píng)分比較差異無(wú)顯著性意義(P>0.05)

14、。
　　 四、XTMM的長(zhǎng)期轉(zhuǎn)歸的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究
　　 XTMM按預(yù)期的設(shè)計(jì)顯示了植入后的轉(zhuǎn)歸,材料內(nèi)部可見自體新生纖維結(jié)締組織呈“蟹足樣”長(zhǎng)入,形成由原植入物和新生自體組織交織在一起的“過(guò)渡態(tài)結(jié)構(gòu)”。呈現(xiàn)新生組織逐漸增加,最終取代殘留植入材料的趨勢(shì)。經(jīng)歷1年的緩慢降解,植入的材料殘留部分仍然保持了比較完整的微觀結(jié)構(gòu),并與周圍新生的纖維組織交織在一起。
　　 結(jié)論
　　 本研究制備的XTMM脫細(xì)胞完全,未見