芥菜籽對(duì)斑馬魚動(dòng)脈粥樣硬化的預(yù)防作用.pdf

1、背景與目的:
　　 動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是動(dòng)脈硬化中常見的最重要的一種，其特點(diǎn)是受累動(dòng)脈病變從內(nèi)膜開始[1-3]。一般先有脂質(zhì)和復(fù)合糖類積聚、出血及血栓形成，纖維組織增生及鈣質(zhì)沉著，并有動(dòng)脈中層的逐漸蛻變和鈣化，病變常累及彈性及大中等肌性動(dòng)脈，一旦發(fā)展到足以阻塞動(dòng)脈腔，則該動(dòng)脈所供應(yīng)的組織或器官將缺血或壞死。由于在動(dòng)脈內(nèi)膜積聚的脂質(zhì)外觀呈黃色粥樣，因此稱為動(dòng)脈粥樣硬化。[4]動(dòng)脈粥樣硬化是西方發(fā)達(dá)

2、國家的主要死亡原因，隨著我國人民生活水平提高和飲食習(xí)慣改變，該病也成為我國主要死亡原因。動(dòng)脈粥樣硬化始發(fā)兒童時(shí)期而持續(xù)進(jìn)展，通常在中年或者中老年出現(xiàn)癥狀。由于動(dòng)脈粥樣硬化斑塊表現(xiàn)為脂質(zhì)和壞死組織的驟聚，因此往往認(rèn)為動(dòng)脈粥樣硬化是退行性病變?，F(xiàn)在認(rèn)為，本病變是多因素共同作用的結(jié)果，[5，6]首先是病變處中性粒細(xì)胞、血小板、巨噬細(xì)胞、及T淋巴細(xì)胞的聚集;其次是包括膠原、彈性纖維及蛋白質(zhì)多糖等結(jié)締組織基質(zhì)和平滑肌細(xì)胞的增生;第三是脂質(zhì)，其中主

3、要含膽固醇結(jié)晶及游離膽固醇和結(jié)締組織。粥樣硬化斑塊中脂質(zhì)及結(jié)締組織的含量決定斑塊的穩(wěn)定性以及是否易導(dǎo)致急性缺血事件發(fā)生。
　　 LDL透過內(nèi)皮細(xì)胞深入內(nèi)皮細(xì)胞間隙，單核細(xì)胞遷入內(nèi)膜，此即最早期。Ox-LDL與巨噬細(xì)胞的清道夫受體結(jié)合而被攝取，形成巨噬源性泡沫細(xì)胞，對(duì)應(yīng)病理變化中的脂紋。動(dòng)脈中膜的血管平滑肌細(xì)胞(SMC)遷入內(nèi)膜，吞噬脂質(zhì)形成肌源性泡沫細(xì)胞，增生遷移形成纖維帽，對(duì)應(yīng)病理變化中的纖維斑塊。ox-LDL使上述兩種泡沫細(xì)

4、胞壞死崩解，形成糜粥樣壞死物，粥樣斑塊形成。從上述動(dòng)脈粥樣硬化形成的機(jī)理可以得知:關(guān)鍵環(huán)節(jié)在于ox-LDL，如何防止LDL被氧化成ox-LDL就成了治療和防止動(dòng)脈粥樣硬化的核心[7-9]。
　　 芥菜籽(mustardseed，MS)又名芥子，是十字花科蕓苔屬植物芥菜的種子，含有芥子油、芥子黏液、多糖和β-谷甾醇等活性成分，其加工的產(chǎn)品芥末油和芥末粉是我們生活中常用的調(diào)味品。近年來對(duì)芥菜籽提取物的研究發(fā)現(xiàn)，芥菜籽不但是良好的天然

5、抗氧化劑，而且具有獨(dú)到的抗衰老功效[4]。而在東方的日本，世界上人均壽命最長的國家，人們普遍有食用芥末的習(xí)慣。而中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)更認(rèn)為白芥（芥菜籽的一種）具有防腐，消積化滯的功效[10-12]。因此明確白芥是否具有抗氧化和防治動(dòng)脈粥樣硬化的作用，有利于我們開發(fā)中西方普遍接受的保健食品和藥品。
　　 盡管利用小鼠模型在研究人類疾病中取得了顯著的成果，但是由于小鼠自身的生物學(xué)特性，使其在遺傳學(xué)[13]，生物發(fā)育學(xué)和疾病模型的研究中的應(yīng)用

6、有一定的局限性。[14]斑馬魚(Daniorerio)是屬于輔鰭亞綱(Actin(O)pterygii)鯉科(Cyprinidae)短擔(dān)尼魚屬（Danio）的一種硬骨魚，原產(chǎn)于印度東部、巴基斯坦、緬甸及孟加拉國，因其體側(cè)具有像斑馬一樣縱向的暗藍(lán)與銀色相間的條紋而得名。斑馬魚繁殖能力強(qiáng)，每對(duì)成魚每周可產(chǎn)300枚受精卵，能快速獲得大量胚胎，其胚胎透明，易于活體觀察，生長發(fā)育快，受精24h后主要器官原基基本形成，便于研究組織器官的發(fā)育和功能[

7、15-17]。因此，斑馬魚成為理想的研究脊椎動(dòng)物發(fā)育的模式動(dòng)物之一，在心血管疾病中血栓、動(dòng)脈血管形成、炎癥、心肌病、心臟再生[18]和先天性心血管疾病等研究中大量應(yīng)用。
　　 材料與方法:
　　 1.斑馬魚:所有動(dòng)物都是在南方醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)的管理?xiàng)l例下處理的。轉(zhuǎn)基(墨)斑馬魚Tg(flk1:cherry)，Tg(lyz∶DsRed)和Tg(coroninala∶eGFP)由香港科技大學(xué)溫子龍教授饋贈(zèng)，其他種類的斑馬魚

8、來自南方醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)教研室中港聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室。AB魚是野生型斑馬魚，做為所有實(shí)驗(yàn)的陰性對(duì)照;Tg(fli1:eGFP)，轉(zhuǎn)基(墨)斑馬魚，綠色熒光蛋白標(biāo)記轉(zhuǎn)錄因子ERGB，特異性的標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞;Tg(flk1:cherry)，轉(zhuǎn)基(墨)斑馬魚，cherry蛋白標(biāo)記內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體2（VEGFR-2），也是特異性標(biāo)記內(nèi)皮細(xì)胞;Tg(lyz∶DsRed)，DsRed標(biāo)記溶解酶3(lysozyme-3)，在粒細(xì)胞中表達(dá);Tg(cor

9、oninala∶eGFP)，轉(zhuǎn)基(墨)斑馬魚，綠色熒光蛋白標(biāo)記冠蛋白(coronin)，這是一種肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，與微管相互作用，標(biāo)記巨噬細(xì)胞。
　　 2.飼料:將普通飼料與不同含量的膽固醇溶解在乙醚中(主要是3％HCD)，充分?jǐn)嚢柚烈颐褤]發(fā)，60℃烤箱烘干，然后研磨至直徑100μm大小的顆粒，分裝。新鮮的芥菜籽，粗壓榨，手工攪拌器攪拌研磨，加入高膽固醇飼料中[19]，制備出不同芥菜籽含量的芥菜籽膽固醇飼料，主要是3％HCD+2

10、.5％MS和3％HCD+5％MS。試驗(yàn)中，依替米貝(ezetimibe)為芥菜籽陽性對(duì)照藥物，它通過抑制腸道膽固醇的吸收來降低血膽固醇，在每次加入飼料之前直接加入水中。
　　 3.斑馬魚的繁殖與喂養(yǎng):斑馬魚養(yǎng)殖在自來水純化系統(tǒng)中，每天接受14小時(shí)光照，10小時(shí)黑暗環(huán)境，斑馬魚3個(gè)月達(dá)性成熟，體外受精，雌雄斑馬魚的交配行為受光刺激，收集受精卵，培養(yǎng)與培養(yǎng)皿中，5dpf大小轉(zhuǎn)至500ml小缸，開始喂養(yǎng)，每天三次，喂養(yǎng)十五天。

11、　　 4.圖像分析:斑馬魚固定，在奧林巴斯熒光共聚焦顯微鏡(FV10-ASW1.7，Tokyo，Japan)下成像，并利用奧林巴斯自帶圖像分析軟件對(duì)平均熒光密度(MIF)進(jìn)行測量和分析。為了保證斑馬魚在拍攝過程中是存活的，將斑馬魚包埋并麻醉在含有0.02％三卡因的0.5％低熔點(diǎn)瓊脂糖中。
　　 5.斑馬魚組織勻漿:在實(shí)驗(yàn)終止階段，將每組50條斑馬魚長時(shí)間暴露在高濃度的三卡因溶液中至安樂死，并將動(dòng)物腹中未消化的食物清除，然后將其

12、浸泡在200ul冰PBS中，利用勻漿器勻漿，并將所得的組織液利用0.45μm濾器過濾，收集勻漿液，待測。
　　 6.脂質(zhì)分析:利用南京建成公司的臨床診斷試劑盒，比色法測得各組勻漿液的總膽固醇(TC)，低密度脂蛋白(LDL)，總甘油三酯(TG)，高密度脂蛋白(HDL)濃度，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　 7.LPO和SOD:測量各組脂質(zhì)過氧化物(LPO)濃度和超氧化物歧化酶(SOD)活力，也是利用的南京建成臨床診斷試劑盒檢測。MD

13、A是LPO中最主要也是最容易測量的一種，所以我們測得MDA濃度來衡量LPO濃度。
　　 8.統(tǒng)計(jì)分析:數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（-x±s）表示，用SPSS13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-WayANOVA)，兩兩比較方差齊性時(shí)采用LSD方法，方差不齊時(shí)采用Dunnett3法，P＜0.05即被認(rèn)為在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有差異。*:p＜0.05，**:p＜0.01;***:p＜0.001。
　　 結(jié)果:
　　 1.3％HCD可

14、以誘導(dǎo)出血管脂質(zhì)堆積。
　　 分別用0％-8％HCD喂養(yǎng)5dpf,fli1-eGFP的斑馬魚幼魚10天(正常飼料、2％、3％、4％、6％、8％HCD)，所有飼料都加有10μg/g的紅色熒光磷脂(cholesterylBODIPY(R)576/589C11;Invitrogen)，用來牢固標(biāo)記膽固醇，以便活體內(nèi)觀察膽固醇的走向與血管壁內(nèi)的沉積。15dpf幼魚，利用含有三卡因的低熔點(diǎn)瓊脂糖固定，在熒光共聚焦顯微鏡下觀察尾部靜脈血管及

15、紅色熒光磷脂堆積情況（40倍物鏡，488nm和559nm激發(fā)光），并對(duì)各組紅色熒光密度進(jìn)行定量?？梢园l(fā)現(xiàn)正常幼魚尾部幾乎無紅色熒光，其他各組幼魚有不同程度的紅色熒光聚集，隨著膽固醇含量的增加，熒光密度越大，面積也越大。但是3％HCD可以誘導(dǎo)出穩(wěn)定的紅色熒光磷脂堆積，所以以后的實(shí)驗(yàn)我們將膽固醇的濃度定為3％。以上結(jié)果可以說明我們復(fù)制出了動(dòng)脈粥樣硬化的斑馬魚模型，下一步也將利用這一模型研究芥菜籽有無抗動(dòng)脈粥硬化功能。補(bǔ)充說明，我們之所以觀察

16、斑馬魚的尾部靜脈血管而不是大動(dòng)脈的原因是斑馬魚的血管結(jié)構(gòu)，在幼魚階段斑馬魚動(dòng)脈和靜脈直接想接，而沒有毛細(xì)血管網(wǎng)，靜脈血流也很迅速，另外的原因是幼魚尾部組織很薄更易于在顯微鏡下觀察。
　　 2.芥菜籽可以降低脂質(zhì)堆積面積。
　　 芥菜籽對(duì)膽固醇誘導(dǎo)的脂質(zhì)堆積有無影響呢？所以我們在3％HCD飼料中加入不同含量的芥菜籽，2.5％、5％、7.5％和10％MS，正常飼料、依替米貝和單純3％HCD飼料作為對(duì)照，同樣膽固醇被紅色熒光磷

17、脂標(biāo)記。喂養(yǎng)5dpf,fli1-eGFP幼魚10天，confocal下觀察，我們發(fā)現(xiàn)2.5％和5％MS組紅色熒光磷脂減少，雖然7.5％和10％MS也有抑制作用但是這兩組幼魚死亡率較高，所以我們選擇2.5％和5％MS作為藥物濃度。藥物對(duì)照依替米貝組也有同樣的降低紅色熒光磷脂聚集的結(jié)果。以上結(jié)果說明芥菜籽具有降低膽固醇堆積，抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用，但是它的作用機(jī)制是什么呢，是否與依替米貝的作用機(jī)制相同呢？
　　 3.芥菜籽和依替米貝對(duì)

18、血脂水平的影響不同。
　　 依替米貝又是公認(rèn)的降血脂藥物，然而芥菜籽和依替米貝具有一致的降脂質(zhì)堆積作用，所以我們將比較芥菜籽干預(yù)和依替米貝干預(yù)下幼魚的血脂水平是否有差異。將各組幼魚隨機(jī)分出50條，組織勻漿，檢測各組幼魚整體的TC、C-LDL、TG和C-HDL。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，芥菜籽不能降低整體TC、C-LDL和C-HDL，但是可以降低TG水平;而依替米貝具有幾乎相反的結(jié)果。以上結(jié)果證明芥菜籽與依替米貝抗動(dòng)脈粥硬化的機(jī)制是不同的，它并不

19、能降低血脂濃度。查找文獻(xiàn)說明芥菜籽具有抗氧化功能，所以我們將進(jìn)一步測定其在動(dòng)脈粥樣硬化狀態(tài)下的整體抗氧化能力。
　　 4.芥菜籽可降低整體氧化產(chǎn)物L(fēng)PO濃度，增強(qiáng)超氧化物歧化酶SOD活力。
　　 與正常飼料喂養(yǎng)組相比，3％HCD喂養(yǎng)組LPO濃度明顯升高，SOD活力明顯下降。EZE和MS組（2.5％和5％）均可以抵抗HCD飼料所導(dǎo)致的LPO的升高作用?？梢源_定芥菜籽具有極強(qiáng)的抗氧化能力。
　　 5.芥菜籽可以抑制中

20、性粒細(xì)胞的募集。
　　 眾所周知，AS是炎癥反應(yīng)，炎癥的早期是中性粒細(xì)胞的參與過程[20，21]。所以我們將檢測不同組斑馬魚尾部的炎癥程度，它的嚴(yán)重程度我們利用尾部的中性粒細(xì)胞個(gè)數(shù)代表。Tg(fli1:eGFP)*Tg(lyz∶DsRed)是一種綠色熒光標(biāo)記血管，紅色熒光標(biāo)記中性粒細(xì)胞的雜交斑馬魚，分組喂養(yǎng)，終末檢測，并對(duì)尾部脂質(zhì)堆積部位進(jìn)行紅色細(xì)胞的計(jì)數(shù)。可以發(fā)現(xiàn)，3％HCD組紅色細(xì)胞個(gè)數(shù)明顯增多，EZE組和MS組中性粒細(xì)胞數(shù)

21、和正常組相比無明顯變化。
　　 6.芥菜籽可以抑制巨噬細(xì)胞的聚集。
　　 泡沫細(xì)胞主要是來源于巨噬細(xì)胞，AS嚴(yán)重程度和進(jìn)展速度與泡沫細(xì)胞的多少有密切關(guān)聯(lián)[7，8，22]。我們將利用另一種轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg(coroninala∶eGFP)（綠色熒光特異性標(biāo)記單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞）來追蹤病變部位巨噬細(xì)胞的變化。結(jié)果可以發(fā)現(xiàn):與正常組相比，3％HCD組脂質(zhì)堆積部位有大量的巨噬細(xì)胞聚集，EZE組和MS組巨噬細(xì)胞數(shù)明顯減少。為了進(jìn)一

22、步說明巨噬細(xì)胞堆積的部位是血管腔還是血管壁內(nèi)，我們利用利用另外一種Tg(flk1:cherry)*Tg(coroninala∶eGFP)轉(zhuǎn)基因斑馬魚，它是一種血管標(biāo)記紅色熒光，巨噬細(xì)胞標(biāo)記綠色熒光的斑馬魚，分組喂養(yǎng)結(jié)果顯示:3％HCD組，大量巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞貼附在血管壁上，而其他幾組貼附的巨噬細(xì)胞明顯下降。
　　 結(jié)論:
　　 1.3％HCD飼料連續(xù)喂養(yǎng)斑馬魚15天，可以復(fù)制出人類動(dòng)脈粥樣硬化早期階段的斑馬魚模型，我們

23、利用這一模型可以觀察斑馬魚AS的早期病變，可以探索AS的早期發(fā)病機(jī)制，還可以用來篩選抗AS早期病變的藥物。
　　 2.芥菜籽與經(jīng)典的抗AS藥物依替米貝作用機(jī)制不同，它不能降低血脂含量但是芥菜籽可以降低LPO的濃度，增強(qiáng)整體SOD活力，從而進(jìn)一步抑制LDL的氧化，具有抗動(dòng)脈粥硬化的作用。
　　 3.芥菜籽可以抑制中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞向血管病變處募集，減輕AS早期炎癥程度，減少巨噬細(xì)胞的聚集，從而減少巨噬細(xì)胞的泡沫樣變，具有