催乳素對子宮內(nèi)膜異位癥患者Th1-Th2平衡的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EM)是育齡期婦女的常見病和多發(fā)病，可導(dǎo)致痛經(jīng)、月經(jīng)失調(diào)和不孕等臨床癥狀，嚴(yán)重影響了女性的健康。近年來EM的發(fā)病率有明顯增高的趨勢，可高達(dá)10％～15％。EM病變廣泛，形態(tài)多樣，雖是良性疾病，卻具有浸潤、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的惡性生物學(xué)行為，成為難治之癥。其病因和發(fā)病機(jī)制至今尚未明確。在此領(lǐng)域的不斷研究，使廣大學(xué)者逐漸認(rèn)識到：免疫功能異常對EM的發(fā)病可能有著重要的影響，特別是機(jī)體免疫平衡狀態(tài)被打破，使E

2、M得以進(jìn)一步的發(fā)生與發(fā)展。已有研究表明，在大多數(shù)EM患者中，特別是期別較晚的EM，機(jī)體Th類細(xì)胞因子的平衡發(fā)生變化，其單個(gè)核細(xì)胞功能發(fā)生改變，從而使其NK細(xì)胞、T細(xì)胞的細(xì)胞毒作用被抑制，從而可能促進(jìn)子宮內(nèi)膜在異位的種植。 先前研究也表明，EM患者全身和局部的催乳素(Prolactin,PRL)水平多呈增高的狀態(tài)，在位及異位內(nèi)膜的PRL及催乳素受體(PRLR)也發(fā)生變化，大部分EM患者伴有高催乳素血癥并合并有不孕，這種現(xiàn)象日益受到

3、人們的重視。鑒于子宮內(nèi)膜是垂體外PRL合成的重要部位，因此，EM患者的高PRL血癥可能是導(dǎo)致EM發(fā)生發(fā)展的重要因素。但目前為止，關(guān)于 PRL 與EM的發(fā)生發(fā)展及與Th平衡之間到底有何關(guān)系，至今仍是一個(gè)謎，三者的關(guān)系值得進(jìn)一步研究。 目前，國內(nèi)外對EM患者Th類細(xì)胞因子與催乳素相關(guān)的研究報(bào)道較少，尤其是對于催乳素在調(diào)節(jié)EM患者Hh1/Th2平衡的研究尚未見報(bào)道。因此，本研究以EM患者為對象，檢測其Th(以IFN-γ為代表)/Th2

4、(以IL-4為代表)兩類細(xì)胞因子的變化情況，并進(jìn)一步運(yùn)用不同濃度重組人催乳素(recombination human prolactin，rhPRL)對EM患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)進(jìn)行調(diào)節(jié)，以期探討催乳素在EM發(fā)病中對Th細(xì)胞因子的作用。 目的： 1．探討EM患者外周血總體T、NK細(xì)胞含量上的差異 2．探討EM患者外周血NK細(xì)胞殺傷功

5、能 3．檢測EM患者外周血細(xì)胞內(nèi)外所表達(dá)的Th1Th2型細(xì)胞因子的表達(dá)情況。 4．探討催乳素在體外對EM患者Th平衡的影響作用。 方法： 1．流式細(xì)胞術(shù)(FACS)檢測子宮內(nèi)膜異位癥患者PBMC中T淋巴細(xì)胞及NK細(xì)胞的數(shù)量變化情況隨機(jī)選取因子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EM)卵巢異位囊腫行剖腹手術(shù)的EM患者28例及同期因不孕癥行腹腔鏡檢查或因子宮肌瘤行子宮全切術(shù)的非EM患者共20例，手術(shù)前抽

6、取肘靜脈血3ml，密度梯度法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血T淋巴細(xì)胞(CD3<'+>)及NK細(xì)胞(CD3<'->CD56<'+>)數(shù)量的變化情況。 2．磁珠分選(MACS)出外周血NK細(xì)胞， LDH法檢測其殺傷功能病例及對照組選擇同上。手術(shù)前抽取頸靜脈血20ml，密度梯度法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，MACS分離出NK細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測其純度，并用LDH法測其殺傷功能的變化。 3．ELISA方法檢測EM患者外周血

7、Th1、Th2細(xì)胞因子變化情況病例及對照組選擇同上。手術(shù)前抽取肘靜脈血3ml，離心收取上清，于-80℃保存留作檢測。采用酶聯(lián)免疫吸附法 (ELISA)，IFN-γ、IL-4檢測試劑盒檢測分析。 4.流式細(xì)胞術(shù)(FACS)檢測EM患者外周血NK表達(dá)的Th1、Th2因子的變化情況隨機(jī)選取因子宮內(nèi)膜異位癥卵巢異位囊腫行剖腹手術(shù)的 EM 患者28例及同期因不孕癥行腹腔鏡檢查或因子宮肌瘤行子宮全切術(shù)的非EM患者共20例，手術(shù)前抽取肘靜脈血

8、5ml，分離單個(gè)核細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血NK細(xì)胞內(nèi)Th1類細(xì)胞(CD3<'->CD56<'+>IFN-γ<'+>細(xì)胞)和TH2類細(xì)胞(CD3<'->CD56<'+>IL-4<'+>細(xì)胞) 的表達(dá)情況。 5.ELISA方法檢測重組人催乳素對EM患者PBMC Th1/Th2細(xì)胞外細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用無菌收集24例EM患者的抗凝外周血5ml,密度梯度離心法無菌分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，24孔板培養(yǎng)，每孔5×10<'5>個(gè)細(xì)胞

9、。設(shè)不同濃度重組人催乳素(rhPRL)刺激組(6.25ng/ml、12.5ng/ml、25ng/ml、100ng/ml、200ng/ml)和空白對照組(0ng/ml)，共培養(yǎng)72小時(shí)后收集上清培養(yǎng)液，于-80℃保存留作檢測。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測上清中Th1類細(xì)胞因子 (IFN-γ)和Th2類細(xì)胞因子(IL-4)的表達(dá)情況。 6.流式細(xì)胞術(shù)(FACS)檢測重組人催乳素(rhPRL)對EM患者外周血細(xì)胞內(nèi)Th1Th2因子

10、的調(diào)節(jié)作用無菌收集15例EM患者的抗凝外周血10ml，無菌分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，24孔板培養(yǎng)，每孔5×10<'5>個(gè)細(xì)胞。設(shè)不同濃度重組人催乳素(recombination human prolactin，rhPRL)刺激組(12.5ng/ml、50ng/ml、200ng/ml) 和空白對照組(0ng/ml)，共培養(yǎng)72小時(shí)后離心收集細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)(FACS)檢測外周血細(xì)胞內(nèi)Th1 類 (IFN-γ<'+>) 和Th2類(

11、IL-4<'+>)細(xì)胞因子的表達(dá)情況。 結(jié)果： 1.EM患者外周血總T細(xì)胞，NK細(xì)胞的含量變化EM患者外周血CD3<'+>T細(xì)胞占外周血總淋巴細(xì)胞比率為 (70.41±7.86)％，與對照組(71.81±4.30)％比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。EM患者外周血CD3<'->CD56<'+>的NK細(xì)胞比例為(4.93±0.87)％與對照組(5.97±2.15)％比較，無明顯變化。(P>0.05)。 2.EM患

12、者外周血NK細(xì)胞殺傷功能的改變經(jīng)MACS分離外周血NK細(xì)胞純度可達(dá)到97％以上；EM患者NK細(xì)胞在效靶比較低時(shí)殺傷率較低，隨效靶比升高，殺傷率隨之上升，10∶1時(shí)殺傷率為49％，20∶1時(shí)殺傷率率為54％。對照組NK細(xì)胞對K562細(xì)胞的殺傷率在39％－63％之間。實(shí)驗(yàn)組與對照組之間的殺傷率在效靶比為5∶1和10∶1時(shí)有顯著性差異(P<0.05)。EM患者外周血NK細(xì)胞殺傷功能較正常人NK細(xì)胞降低。 3.EM患者外周血 Th1 類

13、因子(IFN-γ)和Th2類因子(IL-4)表達(dá)情況： ELISA法檢測EM患者外周血 Th1 類因子(IFN-γ)和Th2類因子(IL-4)表達(dá)情況，結(jié)果顯示： EM患者外周血IFN-γ水平為(109.42±27.54)pg/ml，較正常對照組(154.27±39.12)pg/ml明顯降低(P<0.05)，而IL-4水平為(14.47±1.33)pg/ml，較對照組[(8.08±0.55)pg/ml]增加(P<0.05)。代表

14、 Th 平衡的Th1/Th2(IFN-γ/IL-4)IzL值，EM患者為(3.65±1.59)，較對照組(7.11±1.37)降低(P<0.05)。 4.EM患者外周血NK細(xì)胞所表達(dá)的1類因子(CD3<'->CD56<'+>IFN-γ<'+>)和2類因子(CD3<'->CD56<'+>IL-4<'+>)表達(dá)情況FACS檢測EM患者外周血NK細(xì)胞所表達(dá)的1類因子(CD3<'->CD56<'+>IFN-γ<'+>細(xì)胞)和2類因子(C

15、D3<'->CD56<'+>IL-4<'+>)，結(jié)果顯示：EM患者外周血NK胞所表達(dá)CD3<'->CD56<'+>IFN-γ<'+>表達(dá)比例為(6.84±2.75)％，明顯低于對照組[(16.55±7.00)％](P<0.05)，EM患者CD3<'->CD56<'+>IL-4<'+>表達(dá)比例為(3.62±1.28)％，高于對照組[(1.29±0.55)％](P<0.05)。 5.ELISA法檢測不同濃度rhPRL對EM患者PBM

16、C Th1Th2因子的調(diào)節(jié)作用rhPRL對EM患者PBMC調(diào)節(jié)Th1類Th2類細(xì)胞因子的表達(dá)情況結(jié)果顯示：低濃度rhPRL(12.5ng/ml)上調(diào)Th1類細(xì)胞因子(IFN-γ)的表達(dá)，隨rhPRL濃度的升高，其上升趨勢減緩，主要表現(xiàn)為下調(diào)作用；rhPRL對Th2類因子(IL-4)的作用同前，即低濃度(12.5ng/ml)上調(diào)IL-4的表達(dá)，隨rhPRL濃度增高，表現(xiàn)為IL-4分泌上升趨勢逐漸減緩。代表TH平衡的Th1/Th2(IFN-

17、γ/IL-4)比值，在低濃度(12.5ng/ml) rhPRL作用下，比值達(dá)到最大，在較高濃度rhPRL存在時(shí)，其比值減小，表現(xiàn)為抑制作用。 6.FACS檢測不同濃度rhPRL對EM患者細(xì)胞內(nèi)1類(IFN-γ<'+>)2類(IL-4<'+>)細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用rhPRL對EM患者細(xì)胞內(nèi)1類(IFN-γ<'+>)，2(IL-4<'+>)類細(xì)胞因子調(diào)節(jié)作用的結(jié)果顯示：低濃度(12.5ng/ml)土調(diào)PBMC胞內(nèi) 1 類因子(IFN-

18、γ<'+>)的表達(dá)，隨濃度的增加，上調(diào)作用不明顯，與此類似，rhPRL對PBMC胞內(nèi)2類因子(IL-4<'+>)的調(diào)節(jié)，低濃度(12.5ng/ml)時(shí)抑制IL-4的表達(dá)，在高濃度存在時(shí)，其抑制作用減弱。 結(jié)論： 正常人及EM患者外周血總T、NK細(xì)胞在數(shù)量上沒有差異，但EM患者NK細(xì)胞殺傷功能有所減低；EM患者外周血及NK細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的1、2細(xì)胞因子平衡狀態(tài)發(fā)生改變，表現(xiàn)出Th2優(yōu)勢狀態(tài)；rhPRL對EM患者細(xì)胞內(nèi)外的Th1