基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的地黃毛蕊花糖苷生物合成相關(guān)酶基因的發(fā)掘與鑒定.pdf

1、地黃（Rehmannia glutinosa Libosch）是玄參科地黃屬多年生草本植物，因具有重要的藥用價(jià)值和食用價(jià)值而被廣泛應(yīng)用，在我國(guó)有著悠久的用藥歷史。地黃含有梓醇、毛蕊花糖菅、地黃素和糖類等化學(xué)成分。其中，毛蕊花糖苷作為地黃的指標(biāo)成分之一，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、神經(jīng)保護(hù)和增強(qiáng)記憶力等多種生理活性。由于毛蕊花糖苷在植物界分布廣、毒副作用小和生物活性強(qiáng)而備受研究者青睞，成為了藥物開(kāi)發(fā)的新目標(biāo)。目前，毛蕊花糖苷主要來(lái)源于藥用植

2、物的提取。但是，藥用植物成分復(fù)雜，提取分離難度很大，嚴(yán)重妨礙了對(duì)其的開(kāi)發(fā)和利用;并且人類過(guò)度采挖和種植植物的土地面積的減少，用于提取毛蕊花糖苷的植物資源越來(lái)越匱乏。因此，毛蕊花糖苷生物合成途徑及其相關(guān)酶基因的研究作為開(kāi)發(fā)毛蕊花糖苷的一條重要途徑受到人們重視，而且推測(cè)出部分毛蕊花糖苷生物合成途徑，發(fā)現(xiàn)了少量其上游合成酶基因。但是，目前，尚未見(jiàn)其真正的生物合成途徑報(bào)道，有更多合成基因有待發(fā)掘。本研究以地黃塊根為材料，采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)挖掘其

3、毛蕊花糖苷生物合成相關(guān)酶基因，建立其生物合成途徑;采用RT-PCR技術(shù)驗(yàn)證其關(guān)鍵酶基因的存在;采用qRT-PCR技術(shù)鑒定其合成毛蕊花糖苷的功能;用重組技術(shù)構(gòu)建了其關(guān)鍵酶肉桂酸-4-羥基化酶基因RgC4H的過(guò)表達(dá)載體。主要結(jié)果如下:
　　1、利用第二代高通量測(cè)序Illumina HiSeq2500平臺(tái)對(duì)地黃多個(gè)發(fā)育時(shí)期的組合塊根進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，獲得了一個(gè)具有豐富有關(guān)地黃生物信息的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，共得到了1.498億個(gè)原始序列數(shù)據(jù)，通過(guò)

4、組裝和拼接后最終獲得了平均長(zhǎng)度為678.3bp的96，961個(gè)Final unigenes，篩查出16，294個(gè)EST-SSRs;將這些Final unigenes與Nr、COG、GO、KEGG等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，42，785條得到功能注釋，注釋率達(dá)到44.7％。11,848 Finalunigenes映射到280條KEGG途徑，包含2019種地黃酶。
　　2、通過(guò)把280條KEGG途徑與前人基于穩(wěn)定同位素標(biāo)記前體物喂養(yǎng)試驗(yàn)推測(cè)的毛

5、蕊花糖苷生物合成途徑比較，找到了包含有后者反應(yīng)步驟和反應(yīng)產(chǎn)物的4個(gè)候選KEGG途徑:苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成途徑、苯丙氨酸代謝途徑、酪氨酸代謝途徑和苯丙醇生物合成途徑，建立了毛蕊花糖苷生物合成途徑，涉及到19個(gè)候選毛蕊花糖苷生物合成相關(guān)酶:分支酸變位酶、預(yù)苯酸脫水酶、預(yù)苯酸脫水酶、苯丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、苯丙氨酸解氨酶、4-香豆酸輔酶A連接酶、肉桂酸羥化酶、奎寧酸羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶、香豆酸3-羥化酶、咖啡酰莽草

6、酸酯酶、環(huán)己二烯基脫水酶、預(yù)苯酸脫水酶、酪氨酸酶、酪氨酸脫羧酶、多巴胺β-單加氧酶、伯胺氧化酶、芳基乙醇脫氫酶。根據(jù)酶及其相應(yīng)的基因（Congtigs或者Unigenes）之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系，確定了19個(gè)酶對(duì)應(yīng)的基因。
　　3、根據(jù)酶編號(hào)與Unigene之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系，篩選出酶基因?qū)?yīng)的ORF，進(jìn)而根據(jù)其堿基序列，設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行RT-PCR分析，驗(yàn)證了上述地黃轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中下列八個(gè)酶基因的存在:預(yù)苯酸脫水酶(ADT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(A

7、SP5)、谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT2）4-香豆酸:輔酶A連接酶(4CL)、伯胺氧化酶(AOC3)、肉桂酸-4-羥基化酶(C4H)、奎寧酸羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶(HCT)和香豆酸3-羥化酶(C3'H)。
　　4、為了驗(yàn)證8個(gè)基因合成毛蕊花糖苷的作用，采用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)上述八個(gè)酶基因功能進(jìn)行了預(yù)測(cè)，采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)其在地黃的不同毛蕊花糖苷含量的塊根的發(fā)育階段特異性表達(dá)、在不同毛蕊花糖苷含量地黃品種85-5品種和北京三號(hào)的時(shí)空表達(dá)和基因

8、型特異性表達(dá)，分析其表達(dá)量與毛蕊花糖苷含量的相關(guān)性。結(jié)果表明所選的八個(gè)酶基因和毛蕊花糖苷生物合成呈正相關(guān)。
　　5、為了進(jìn)一步用基因過(guò)表達(dá)技術(shù)驗(yàn)證8個(gè)基因合成毛蕊花糖苷的作用，根據(jù)地黃轉(zhuǎn)錄組測(cè)序所得的RgC4H的ORF，成功克隆了地黃肉桂酸-4-羥基化酶RgC4H的完整CDS區(qū)，并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。結(jié)合植物表達(dá)載體pCAMBIA1300的多克隆位點(diǎn)，設(shè)計(jì)了帶有酶切位點(diǎn)的引物，通過(guò)RT-PCR從地黃中得到了RgC4H的全長(zhǎng)c