根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)亞精胺合成酶基因MdSPDS1的柑橘遺傳轉(zhuǎn)化及離體再生.pdf

1、柑橘是世界上具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的大宗水果。在柑橘的生產(chǎn)過程中，由于冷害、凍害、鹽害等環(huán)境脅迫的影響，其果實(shí)的產(chǎn)量和品質(zhì)都會(huì)明顯的下降，人工栽培管理雖然在一定的程度上減少這些傷害，但成效有限。通過育種手段，選育能抵御環(huán)境脅迫的優(yōu)質(zhì)新品種，是解決這一問題的根本途徑。柑橘的遺傳轉(zhuǎn)化以其自身的優(yōu)勢(shì)，為柑橘新品種育種提供了一條新的途徑。 本研究以9個(gè)品種的柑橘胚性愈傷及金錢橘、冰糖橙上胚軸切段為試材，采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將亞精胺合成酶基因

2、，轉(zhuǎn)入柑橘，以判定多胺的超量表達(dá)對(duì)柑橘生長(zhǎng)發(fā)育及抗逆境能力的影響，為進(jìn)一步的抗性育種奠定基礎(chǔ)。同時(shí)，還對(duì)柑橘遺傳轉(zhuǎn)化高效再生體系的完善進(jìn)行了探索。研究結(jié)果如下： 1．共獲得了11種Km抗性柑橘材料：朋娜臍橙、暗柳橙、意大利血橙、冰糖橙、四季橘、墨西哥來檬以及山金柑等7種Km抗性胚性愈傷組織；默科特橘橙、澳洲指橘以及紅馬敘葡萄柚等3種Km抗性胚狀體以及23株轉(zhuǎn)基因金錢橘并移栽至溫室中。 2．發(fā)現(xiàn)當(dāng)共培養(yǎng)培養(yǎng)基pH值為5.4

3、時(shí)，以金錢橘上胚軸切段為外植體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化獲得的抗性芽比率最高。以柑橘胚性愈傷組織為外植體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化中，基因型對(duì)抗性愈傷獲得率影響很大：山金柑、朋娜臍橙以及紅馬敘葡萄柚較易（大于15％）；暗柳橙、默科特橘橙以及澳洲指橘居中（5～15％）；意大利血橙、四季橘以及墨西哥來檬較難（小于5％）。 3．在形態(tài)學(xué)上，轉(zhuǎn)基因金錢橘與未轉(zhuǎn)化對(duì)照在株形和生長(zhǎng)勢(shì)上差異不明顯，但在葉形指數(shù)、葉面積、葉色等方面存在微小差異。 4．在經(jīng)受相同程

4、度的逆境脅迫［（高溫（45℃保濕6h）、低溫（-6℃冰箱中6h）、高鹽（300mmol／L NaCl溶液中6h）以及高滲（20％PEG6000溶液中6h）］下，轉(zhuǎn)基因金錢橘的葉片比未轉(zhuǎn)化對(duì)照植株葉片的相對(duì)電導(dǎo)率低，轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗逆性。用10gmol／L百草枯（Paraquat）處理葉片后，未轉(zhuǎn)化植株葉片中的葉綠素含量下降為未處理前的46.9％，而轉(zhuǎn)基因植株葉片中的葉綠素含量下降較少，仍然能達(dá)到相應(yīng)未處理前的84.3％，轉(zhuǎn)基因植

5、株對(duì)由百草枯誘導(dǎo)的氧化脅迫表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗逆性。 5．柑橘的離體再生體系的完善和創(chuàng)新方面：冰糖橙上胚軸切段誘導(dǎo)不定芽的試驗(yàn)中，對(duì)培養(yǎng)基中添加BA、NAA、蔗糖、AgNO<,3>、活性炭等物質(zhì)對(duì)不定芽的萌發(fā)率進(jìn)行了6因子5水平的正交試驗(yàn)研究，得出最適合的生芽培養(yǎng)基配方（MT+2.0mg／LBA+0.5mg／LNAA+20g／L蔗糖+8mg／L谷氨酰胺+2.0mg／L AgNO<,3>+0％活性炭+5g／L瓊脂，pH 5.8）。在柑橘