根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)MdSPDS1和HAL2基因轉(zhuǎn)化柑橘的研究.pdf

1、柑橘是世界上最重要的水果之一，其面積和產(chǎn)量在所有水果種類中均居第一位，在人們?nèi)粘Ｉ钪姓加兄匾牡匚?。但是柑橘產(chǎn)業(yè)中還存在著很多問題，如病蟲害及自然災(zāi)害危害嚴(yán)重，成熟期過于集中，品種結(jié)構(gòu)不合理等。全世界大約有20％可耕土地及一半以上的水澆田受鹽漬化影響，并且這種影響在日益加劇，我國(guó)也大約有5億畝鹽漬化土地。因?yàn)楦涕偕洗嬖谕陂L(zhǎng)、多胚性和珠心胚現(xiàn)象、遺傳的高度雜合及單性結(jié)實(shí)等特點(diǎn)，利用常規(guī)育種方法進(jìn)行抗鹽品種改良受到限制，影響了育種工作的

2、進(jìn)行。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法的突破，以及各類植物抗逆相關(guān)基因的克隆，為柑橘抗逆基因工程奠定了基礎(chǔ)。 本研究以優(yōu)良柑橘甜橙品種的愈傷組織和上胚軸為外植體，利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化MdSPDS1和HAL2基因，期望能夠獲得抗鹽的新種質(zhì)。主要研究結(jié)果如下： 1.研究卡那霉素對(duì)朋娜臍橙和佛羅斯特臍橙胚性愈傷組織的影響。確定了在柑橘轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中，篩選抗性愈傷組織的適宜卡那霉素濃度為50 mg／L。 2.對(duì)椪柑和錦橙的上胚軸再

3、生體系進(jìn)行了初步研究。結(jié)果表明：BA對(duì)上胚軸再生影響最大，當(dāng)BA濃度為1.0 mg／L時(shí)，再生頻率最高；椪柑上胚軸水平和垂直放置時(shí)最適宜的再生培養(yǎng)基分別為：MT+1.0 mg／L BA+0.5 mg／L IAA和MT+1.0 mg／LBA+1.0 mg／L IAA；錦橙上胚軸水平放置時(shí)最適宜的再生培養(yǎng)基為：MT+1.0 mg／LBA+0.5 mg／L IAA。 3.對(duì)影響朋娜臍橙愈傷組織轉(zhuǎn)化效率的有關(guān)因子進(jìn)行了初步優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)表明

4、：當(dāng)侵染時(shí)間為15－20 min、侵染濃度OD<,600>值為0.8、共培養(yǎng)天數(shù)為3 d時(shí)，轉(zhuǎn)化效率最高。 4.MdSPDS1基因和HAL2基因轉(zhuǎn)化朋娜臍橙獲得抗性愈傷組織，經(jīng)多次選擇繼代，生長(zhǎng)正常，分別經(jīng)nptⅡ和35S-MdSPDS1、nptⅡ和HAL2引物PCR擴(kuò)增分析鑒定證實(shí)為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物。 5.將得到的MdSPDS1基因轉(zhuǎn)化朋娜臍橙的轉(zhuǎn)基因系進(jìn)行鹽脅迫（100mM），結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因系愈傷的鮮重增殖比對(duì)照要高，電導(dǎo)