根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的柑橘轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化與轉(zhuǎn)LFY、AP1基因植株的培育.pdf

1、柑橘是世界上最重要的常綠果樹(shù)之一,其種植面積和總產(chǎn)量均居水果之首。長(zhǎng)期以來(lái),運(yùn)用傳統(tǒng)的育種手段進(jìn)行柑橘遺傳改良受到珠心胚干擾、性器官敗育、育種周期長(zhǎng)以及遺傳上高度雜合等因素的影響,導(dǎo)致育種進(jìn)程緩慢。轉(zhuǎn)基因技術(shù)自1983年應(yīng)用到植物育種以來(lái),發(fā)展迅猛,已經(jīng)成為基因功能鑒定不可缺少的手段,也是實(shí)現(xiàn)植物目標(biāo)性狀改良的一種快速和直接的途徑。植物童期長(zhǎng)短受開(kāi)花基因調(diào)控,將開(kāi)花調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)入植物有望改變童期。本研究以擬南芥花分生組織特異基因LEAFY

2、(LFY)、APETALA1(AP1)為目標(biāo)基因,以胚性愈傷組織和實(shí)生苗上胚軸分別為外植體,通過(guò)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行柑橘遺傳轉(zhuǎn)化研究,采用GUS組織化學(xué)染色和PCR、Southern blotting等技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)基因材料進(jìn)行鑒定,采用real-time PCR技術(shù)進(jìn)行基因表達(dá)分析；對(duì)不同基因型愈傷組織轉(zhuǎn)化率存在差異的因?yàn)檫M(jìn)行了探討；對(duì)AP1、LFY基因與內(nèi)源開(kāi)花相關(guān)基因間的互作進(jìn)行了分析,并對(duì)AP1促進(jìn)早花的機(jī)理進(jìn)行初步研究:主要結(jié)果如下

3、:
　　 1.柑橘基因型、愈傷組織褐化影響轉(zhuǎn)化率。對(duì)15種不同基因型柑橘胚性愈傷組織的轉(zhuǎn)化特性進(jìn)行研究的結(jié)果表明,a)在篩選過(guò)程中,抗性愈傷組織多從褐化組織中再生；b)不同基因型愈傷組織褐化程度不同,其中寬皮橘類及其雜種類基因型愈傷組織的褐化最為嚴(yán)重,山金柑和葡萄柚次之,澳洲指橘和伏令夏橙與金柑體細(xì)胞雜種的愈傷組織不褐化,甜橙類愈傷組織的褐化表現(xiàn)為褐化、輕微褐化和不褐化；c)褐化嚴(yán)重的柑橘基因型轉(zhuǎn)化率較高,而不褐化類型轉(zhuǎn)化率較低

4、,表明愈傷組織的褐化程度與轉(zhuǎn)化率有關(guān)；d)愈傷組織的褐化與其本身的總多酚含量有關(guān),總多酚含量高的易表現(xiàn)褐化,而總多酚含量受基因型的影響。綜上所述,推測(cè)在根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的柑橘胚性愈傷組織的遺傳轉(zhuǎn)化中,基因型通過(guò)愈傷組織的褐化間接影響轉(zhuǎn)化率。而柑橘愈傷組織轉(zhuǎn)化pBIN-mGFP5的GFP瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果,表明總多酚含量高的寬皮橘類及其雜種類基因型的轉(zhuǎn)化率顯著高于總多酚含量低的柑橘基因型,與前面結(jié)果相一致。
　　 2.在前人研究基礎(chǔ)上,進(jìn)

5、一步優(yōu)化了柑橘愈傷組織轉(zhuǎn)化再生體系,建立了5步篩選再生法?；谠擉w系,獲得19種基因型的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系245個(gè),其中6種基因型再生,獲得120個(gè)轉(zhuǎn)基因芽系,有34個(gè)轉(zhuǎn)基因株系移栽成活,主要表現(xiàn)在,
　　 1)冰糖橙胚性愈傷組織轉(zhuǎn)化:a)獲得轉(zhuǎn)AP1基因的轉(zhuǎn)化細(xì)胞系7個(gè),胚狀體再生率高達(dá)88％；再生芽經(jīng)GUS染色、PCR分析鑒定為陽(yáng)性,Southern雜交結(jié)果表明所檢測(cè)的4個(gè)轉(zhuǎn)化細(xì)胞系中AP1基因均以單拷貝插入；再生芽生根困難,通過(guò)

6、試管嫁接獲得了完整植株,但嫁接苗在生長(zhǎng)后期表現(xiàn)落葉、芽枯、死亡:b)獲得轉(zhuǎn)LFY基因的轉(zhuǎn)化細(xì)胞系2個(gè),其中一個(gè)獲得再生植株,經(jīng)GUS染色、PCR分析鑒定為陽(yáng)性,Southern雜交結(jié)果表明LFY基因以3個(gè)拷貝插入；再生植株初期生長(zhǎng)健壯,移栽后表現(xiàn)株形矮小,分枝多,葉片小,整株成叢狀。以上結(jié)果表明API、LFY對(duì)植株生長(zhǎng)有較大影響。
　　 2)椏柑胚性愈傷組織轉(zhuǎn)化:a)獲得轉(zhuǎn)LFY基因的轉(zhuǎn)化細(xì)胞系9個(gè),其中4個(gè)細(xì)胞系獲得再生植株,

7、有3個(gè)細(xì)胞系經(jīng)PCR檢測(cè)為陽(yáng)性,Southern雜交結(jié)果表明外源基因以單拷貝插入；b)獲得轉(zhuǎn)AP1基因的轉(zhuǎn)化細(xì)胞系113個(gè),其中再生細(xì)胞系61個(gè),移栽植株104棵,源自29個(gè)株系；移栽株系經(jīng)GUS染色、PCR分析,表明有93％為陽(yáng)性,經(jīng)Southern雜交表明外源基因以1-2個(gè)拷貝插入；轉(zhuǎn)基因植株腋生組織生長(zhǎng)旺盛,多有2-4個(gè)分枝/株,與未轉(zhuǎn)化對(duì)照形態(tài)差異較大；real-time RT-PCR結(jié)果表明AP1基因在芽中表達(dá)量最高,其次是根

8、,而在愈傷組織與胚狀體中表達(dá)量較低,內(nèi)源開(kāi)花基因CiAP1、CiLFY、CiFT、CiTFL受AP1基因影響發(fā)生上調(diào)或下調(diào)表達(dá)。
　　 3)其他基因型愈傷組織轉(zhuǎn)AP1基因獲得轉(zhuǎn)化植株的有,伏令夏橙、Succari甜橙、改良橙與尾張雜種、茶枝柑。
　　 3.以實(shí)生苗上胚軸為試材進(jìn)行轉(zhuǎn)化,獲得3種基因型的GUS陽(yáng)性株系42個(gè),其中21個(gè)株系移栽成活,18個(gè)株系經(jīng)PCR鑒定為陽(yáng)性。一株轉(zhuǎn)AP1基因的金柑表現(xiàn)早花性狀。Real-

9、time RT-PCR結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因(LFY、AP1)對(duì)內(nèi)源開(kāi)花相關(guān)基因的表達(dá)有較大影響。以上結(jié)果主要表現(xiàn)在,
　　 1)金柑實(shí)生苗上胚軸轉(zhuǎn)化AP1基因:從1021個(gè)外植體中獲得GUS陽(yáng)性芽19個(gè),平均轉(zhuǎn)化率為1.86％；從移栽的8株GUS陽(yáng)性植株中,有6株經(jīng)PCR鑒定為陽(yáng)性,其中3株(J3、J10、J17)進(jìn)行了Southern雜交鑒定,表明外源基因以1-5個(gè)拷貝插入。轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)正常,但平均分枝數(shù)/株大于未轉(zhuǎn)化對(duì)照。轉(zhuǎn)基因

10、植株(J3)在移栽11個(gè)月后開(kāi)花,而正常植株需3年左右才可開(kāi)花,表明金柑中異位表達(dá)AP1基因可以促進(jìn)早花。Real-time RT-PCR結(jié)果表明AP1基因表達(dá)量與其插入的拷貝數(shù)成正相關(guān),而與開(kāi)花早晚無(wú)關(guān)；AP1基因通過(guò)促進(jìn)CiLFY與CiFT的表達(dá),抑制CiTFL的表達(dá)促進(jìn)開(kāi)花。
　　 2)冰糖橙上胚軸切段轉(zhuǎn)化LFY基因:最終轉(zhuǎn)化率為8.88％；獲得1株轉(zhuǎn)AP1基因和12株轉(zhuǎn)LFY基因的GUS陽(yáng)性植株；轉(zhuǎn)化植株生長(zhǎng)正常,與未轉(zhuǎn)

11、化對(duì)照無(wú)明顯差異；PCR分析表明,除一株轉(zhuǎn)化LFY基因的植株為陰性外,其余均為陽(yáng)性；轉(zhuǎn)LFY基因植株(B1)經(jīng)Southern雜交鑒定,表明外源基因以單拷貝形式插入；real-timeRT-PCR結(jié)果表明LFY基因在不同轉(zhuǎn)基因株系中表達(dá)量不同,根中表達(dá)量略低于芽；內(nèi)源開(kāi)花基因CiAP1、CiLFY、CiFT在不同轉(zhuǎn)化株系中分別表現(xiàn)上調(diào)或下調(diào)表達(dá),CiTFL在所有轉(zhuǎn)化株系中均表現(xiàn)下調(diào)表達(dá),表明LFY基因影響內(nèi)源開(kāi)花相關(guān)基因的表達(dá)。