Ⅰ、低劑量棉酚和甾體激素聯(lián)合應用對大鼠睪丸Cyclin D1、P63和PKC-α表達的影響;Ⅱ、部分切除魚尾后的尾鰭再生.pdf

1、第一部分低劑量棉酚和甾體激素聯(lián)合應用對大鼠睪丸Cyclin D1、P63和PKC-α表達的影響
　　 男性避孕藥發(fā)展遠遠落后于女性避孕藥，至今仍無安全、有效、無副作用的男性避孕藥面市。我室經(jīng)多年研究發(fā)現(xiàn)，低劑量棉酚和c體激素聯(lián)合用藥可基本滿足了副作用低和生殖能力可逆性恢復的要求。與單獨使用棉酚和堵體激素相比，棉踏聯(lián)合用藥起效更快，兩者在抗生育效果方面具有協(xié)同作用，但是尚不明確兩者發(fā)揮協(xié)同作用位點。棉拼聯(lián)合用藥具有抗生育作用，能夠

2、影響睪丸中細胞的增殖、凋亡和分化等過程。而Cyclin D1和P63在細胞的增殖過程中起作用，所以棉聯(lián)合用藥可能影響Cyclin D1和P63的表達。PKC分布和作用廣泛，棉拼聯(lián)合用藥的抗生育作用，也可能影響PKC。在睪丸中的表達。成年雄性大鼠被隨機分為四組，喂服棉酚12.5mg/kg"d+去氧孕烯0.125mg/kgd+炔雌醇0.025mg/kg"d+十一酸睪酮100mg/kg"d的聯(lián)合用藥組(GH組)，單獨喂服相同劑量棉酚12.5m

3、g/kg.d的棉酚組((G組)、單獨喂服相同劑量激素，去氧孕烯0.125mg/kg"d+炔雌醇0.025mg/kg"d+十一酸睪酮100mg/kg"d的激素組((H組)以及喂服載體溶劑190甲基纖維素的陰性對照組(C組)。用藥后6,8和10周取翠丸和附翠組織，應用免疫組化和Western blot技術(shù)，檢測cyclin D1, P63和PKC- a的表達變化，以尋找聯(lián)合用藥對精原細胞的作用分子。研究結(jié)果顯示，棉拼聯(lián)合用藥可有效地抑制精子

4、發(fā)生，減少附睪成熟精子的數(shù)量，并且使睪丸和附睪的重量和體積明顯變小。在本實驗中，Cyclin D1蛋白免疫組化的結(jié)果為，Cyclin D1蛋白主要在生精小管管腔面的殘余體中表達也在生精小管之間的睪丸間質(zhì)中表達。在棉酚聯(lián)合用藥4w和lOw后，各組間無明顯差異。而Western blot結(jié)果顯示4w各組中，C組的表達量明顯高于其它三組，( FCO.05);lOw各組中，C組的表達量明顯低于其它三組，(FRO.05)。在棉出聯(lián)合用藥4w后，H

5、和GH組的P63蛋白質(zhì)在生精小管之間的睪丸間質(zhì)中的表達，與C和G組對比有所減弱，用藥lOw后明顯減弱，而對其Western blot結(jié)果沒有明顯影響。在棉酚聯(lián)合用藥lOw后，免疫組織化學結(jié)果顯示，H和GH組的PKC-a蛋白質(zhì)在生精小管之間的睪丸間質(zhì)中的表達，與C和G組對比明顯減弱。PKC-。蛋白表達的Western blot結(jié)果為，4w的GH組與4w的C, G和GH組比較，PKC- a蛋白表達明顯下降(P0.05)。1Ow的H和GH組與

6、lOw的C和G組比較，PKC-蛋白表達明顯下降(fCO.05)，C和G兩組間沒有明顯的差異。以PBS代替一抗的陰性對照，均未見陽性著色區(qū)，可見對三種蛋白的免疫組化的結(jié)果是特異性的總之，棉酚聯(lián)合用藥可有效地抑制精子發(fā)生，減少附睪成熟精子的數(shù)量，并且使睪丸和附睪的重量和體積明顯變小。免疫組化的結(jié)果提示，在棉酚聯(lián)合用藥lOw后，H和GH組的P63和PKC-a蛋白質(zhì)在相應部位的表達，與C和G組對比明顯減弱。以PBS代替一抗的陰性對照，均未見陽性

7、著色區(qū)，可見免疫組化的結(jié)果是特異性的。Western blot結(jié)果提示，在棉晰聯(lián)合用藥lOw后，三種基因在整個大鼠翠丸的總體蛋白表達量中，只有PKC-的下降。
　　 第二部分部分切除魚尾后的尾鰭再生
　　 所有的生物體對損傷都有生物反應，但是它們再生的能力卻大不相同。這種自身穩(wěn)定的更新機制是固有的特殊潛系干細胞所介導的。在這方面，硬骨魚和兩棲動物受到特別的關(guān)注，因為能夠再生受損傷的器官包括部分心臟，脊髓，視網(wǎng)膜，和肢體/

8、鰭。相對簡單和易獲得的尾鰭成為解析骨等再生分子機制的良好體系。在內(nèi)骨骼水平切除鰭將不會有再生，在真皮鰭條切除將引起丟失結(jié)構(gòu)大約3周內(nèi)完全恢復。許多基因在鰭再生過程中的作用己經(jīng)被研究。視黃酸(RA)能夠改變再生尾鰭的生長情況和形態(tài)。有報道觀察到躋魚的含有肌肉和魚鱗的尾部。但是，有關(guān)經(jīng)過斷尾切除術(shù)后的鰭再生實驗還沒有報道。斷尾再生的尾鰭再生于具有內(nèi)骨骼和肌肉組織的魚尾部分，這與現(xiàn)有的認識不同。但是當鱗魚被捕到網(wǎng)里后都拼命掙扎而死去，所以不能

9、夠用魷魚做斷尾再生的實驗。四種魚，包括草魚、普通鯉魚、鯉魚和斑馬魚，用于研究魚的斷尾后尾鰭再生。魚尾切斷術(shù)是指切除部位在具有肌肉、內(nèi)骨骼和魚鱗的魚尾的遠側(cè)邊緣內(nèi)側(cè)1-2 mm處;近側(cè)尾鰭切斷術(shù)是指切除部位在具有肌肉、內(nèi)骨骼和魚鱗的魚尾的遠側(cè)邊緣外側(cè)1-2 mm處;遠側(cè)尾鰭切斷術(shù)是指切除部位恰好在尾鰭分岔前。魚鰭經(jīng)過固定、脫鈣、包埋、切片。切片再經(jīng)過脫蠟、梯度水化，進行H-E染色。將切下的魚尾或者尾鰭固定清洗，在過濾的0.1％阿辛藍溶液中

10、染色、脫水，然后轉(zhuǎn)入溶于0.5％ KOH的0.1％茜素紅溶液中染色。在應用BrdU進行染色的實驗中，將魚腹腔注射BrdUo固定后切片脫蠟，應用鼠源BrdU一抗處理，DAB顯色。再生尾鰭中的細胞凋亡情況，應用TUNEL檢測試劑盒，按照說明書中的方法進行檢測。在魚缸中加入RA至終濃度為10 M，每天更換水和RA，連續(xù)4天。尾鰭切斷術(shù)后，再生的錦鯉尾鰭比普通鯉魚的分岔早。有的紅色普通鯉魚在它們再生的尾鰭上有較多的黑色素。在魚尾或者尾鰭切斷術(shù)后

11、的尾鰭再生有區(qū)別。斷尾后的尾鰭再生率約為50％，而尾鰭切斷術(shù)后的再生率為100％。只有一部分斷尾后再生尾鰭比較完整，而所有尾鰭切斷術(shù)后再生的尾鰭均完整。在魚尾切斷術(shù)后2-4周，才一有肉眼可見的尾鰭再生，而在尾鰭切斷術(shù)后3天就可以見到。前者從具有肌肉、內(nèi)骨骼和魚鱗的尾部部分再生，而后者再生源于具有鰭條的尾鰭部位。一些草魚的尾部經(jīng)過切斷術(shù)后2個多月，再生出不規(guī)則的部分尾鰭。斷尾術(shù)后42天，單純用肉眼仍然不能夠看出明顯的鰭條，鰭條樣條狀物是血

12、管。這條普通鯉魚己經(jīng)斷尾后3個月，再生出從形狀上看完整的尾鰭已經(jīng)1個月了，但是也不能夠在再生的尾鰭上看到鰭條。在普通鯉魚具有肌肉的尾后緣遠側(cè)1-2 mm處切斷尾鰭，在一個月后再生出從形狀上看完整的尾鰭，2個月后的再生尾鰭具有肉眼可見的鰭條。錦鯉斷尾再生的尾鰭中有豐富的血管，但是沒有明顯的鰭條。斷尾鰭后尾鰭再生的概率為100％，多數(shù)都能夠再生出完整的尾鰭。斑馬魚斷尾后再生尾鰭的概率約為50％,而再生的尾鰭中，只有一部分再生比較規(guī)則和完整。

13、當斷尾再生的尾鰭達到2 mm時，就可以看到鰭條，而不能夠看到血管。在普通鯉魚斷尾后，很少的情況下尾部斷端被魚鱗樣物質(zhì)覆蓋。經(jīng)過阿辛藍和茜素紅染色，斷尾再生錦鯉和斑馬魚的尾鰭與正常的以及斷鰭再生的錦鯉和斑馬魚尾鰭顯示出明顯的區(qū)別。斷尾再生的普通鯉魚尾鰭經(jīng)過H-E染色，顯示在含有肌肉的尾部區(qū)域年和再生的尾鰭之間有不光滑的部分。斷尾再生的尾鰭經(jīng)過BrdU整合處理后，應用DAB檢測顯示增殖細胞位于再生尾鰭的邊緣。TUNEL檢測結(jié)果顯示凋亡細胞主

14、要存在于尾鰭的邊緣。對斑馬魚進行斷尾處理和RA處理，2個月以后，僅僅有一條再生出很小的尾鰭，用肉眼很難看到，再過了一個月也沒有發(fā)現(xiàn)進一步的生長。斑馬魚經(jīng)過斷尾處理后，再生為期的概率約為50％，然而，經(jīng)過斷尾處理和RA處理后，沒有斑馬魚能夠再生出肉眼容易看到的尾鰭。與斷尾后再生尾鰭的實驗不同，經(jīng)常有人做斷尾鰭后再生尾鰭的相關(guān)實驗。實驗顯示四種魚:草魚、普通鯉魚、錦鯉和斑馬魚，在斷尾后能夠再生尾鰭。斷尾再生的尾鰭起源自具有肌肉、內(nèi)骨骼和鱗片

15、的尾部。這與當前的認識一在內(nèi)骨骼水平切斷處理后不會再生一是不同的。在斷尾再生的尾鰭中，應用TUNEL方法也檢測到細胞凋亡。這樣，可能去分化和干細胞激活都對芽基的形成起作用。盡管細胞的去分化現(xiàn)象只在兩棲動物肢體和尾巴再生過程中得到證實，經(jīng)過對斑馬魚再生尾鰭的芽基的形態(tài)學，本體論和基因表達研究，提示斑馬魚鰭再生存在相似的機制。魚經(jīng)過斷尾處理后的橫切面處的尾部組織與四足動物再生部位有相似的結(jié)構(gòu)。因此，斷尾再生尾鰭有可能揭示一個普遍的原理，即在