中藥單體化合物L(fēng)ariciresinol對(duì)樹突狀細(xì)胞功能的調(diào)控作用及其機(jī)制研究.pdf

1、免疫抑制劑具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值，廣泛應(yīng)用于器官移植抗排斥反應(yīng)和自身免疫性疾病的治療，常見的免疫抑制劑有糖皮質(zhì)激素、維生素D3、環(huán)孢素A、雷帕霉素、它克莫司等。這些免疫抑制劑在臨床應(yīng)用的過程中，在產(chǎn)生治療效應(yīng)的同時(shí)，也具有一定的副作用，因此，研發(fā)新的具有治療作用的免疫抑制劑意義重大。作為我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中的瑰寶，中草藥對(duì)疾病的預(yù)防和治療作用，尤其是對(duì)炎癥、感染、腫瘤、自身免疫、移植排斥等疾病的預(yù)防和治療作用，主要是通過免疫系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的。中藥中

2、很可能存在具有免疫抑制作用的成分，發(fā)現(xiàn)這些成分并研究其功能具有理論和應(yīng)用價(jià)值。由于樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells，DCs)是機(jī)體免疫應(yīng)答中的關(guān)鍵細(xì)胞，該類細(xì)胞也很可能是免疫抑制劑的主要的靶細(xì)胞，因此，以DCs作為靶細(xì)胞很可能篩選到具有抑制作用的中藥成分。鑒于此，我們課題組與第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院張衛(wèi)東教授課題組合作，利用基于DCs分化發(fā)育和功能成熟的藥物篩選平臺(tái)，從496種中藥單體化合物中成功篩選出18類31個(gè)有效單體成分。并選

3、擇對(duì)DCs分化發(fā)育抑制率較高，而本身的細(xì)胞毒性較小，且能有效促進(jìn)DCs分泌IL-10的免疫抑制性的絲毛瑞香的提取物L(fēng)ariciresinol(分子式C20H21O6)作為研究對(duì)象，深入研究該成分對(duì)DCs的調(diào)控及其機(jī)制；并使用過敏性自身免疫反應(yīng)性腦脊髓膜炎(EAE)模型研究了其在體內(nèi)應(yīng)用的有效性。
　　 (一)中藥單體化合物L(fēng)ariciresinol對(duì)DCs功能的影響
　　 以本身的細(xì)胞毒性較小，且能有效促進(jìn)DCs分泌IL

4、-10的Lariciresinol成分為研究對(duì)象，研究了Lariciresinol對(duì)DCs的凋亡誘導(dǎo)作用、對(duì)DCs吞噬功能、成熟表型、細(xì)胞因子分泌、激發(fā)同種異體免疫反應(yīng)和抗原提呈能力的影響。我們以GM-CSF和IL-4誘導(dǎo)小鼠骨髓細(xì)胞生成DCs，并使用藥物處理第五天的未成熟DCs24小時(shí)，再用終濃度為100ng/ml的LPS刺激24小時(shí)，檢測(cè)相應(yīng)指標(biāo)。使用FACS檢測(cè)annexin V和PI的方法確定了16nmol/ml為L(zhǎng)aricir

5、esinol對(duì)未成熟DCs的無毒性濃度范圍。后期的研究發(fā)現(xiàn)，Lariciresinol不能影響DCs的吞噬和分泌IL-12P70、TNF-α和TGF-β的能力，卻能明顯促進(jìn)抑制性細(xì)胞因子IL-10的分泌，并能抑制DCs激發(fā)同種異體免疫反應(yīng)(MLR)和特異性抗原提呈能力。
　　 (二)中藥單體化合物L(fēng)ariciresinol促進(jìn)DCs分泌IL-10的機(jī)制研究
　　 IL-10是一種重要的具有免疫負(fù)調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子。Lar

6、iciresinol是如何促進(jìn)IL-10分泌的呢?進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Lariciresinol對(duì)DCs分泌IL-10的促進(jìn)具有Lariciresinol濃度梯度依賴性和LPS的濃度梯度依賴性。那么，促進(jìn)的信號(hào)通路如何呢?我們采用Western Blot技術(shù)，Lariciresinol處理第五天的未成熟DCs24小時(shí)，再加入終濃度為100ng/ml的LPS，并在第0、15、30和60分鐘，裂解細(xì)胞，收集蛋白檢測(cè)ERK1/2、p38和JNK的

7、磷酸化情況，發(fā)現(xiàn)Lariciresinol能夠明顯增強(qiáng)ERK1/2的磷酸化；ERK1/2信號(hào)通路抑制劑PD98059能夠抑制Lariciresinol對(duì)DCs的IL-10分泌促進(jìn)作用，另外，p38信號(hào)通路抑制劑SB203580，亦能抑制Lariciresinol促進(jìn)的IL-10分泌作用。由此，證明了Lariciresinol通過ERK1/2信號(hào)通路促進(jìn)DCsIL-10的分泌，而對(duì)P38信號(hào)可能具有基礎(chǔ)性的活化作用。
　　 (三)

8、中藥單體化合物L(fēng)ariciresinol處理的DCs過繼轉(zhuǎn)移和Lariciresinol體內(nèi)注射均能抑制自身免疫病的發(fā)生
　　 既然，Lariciresinol可以明顯促進(jìn)DCs分泌IL-10的能力，并能部分抑制DCs的成熟和抗原提呈能力，那么，Lariciresinol處理的DCs能否通過誘導(dǎo)免疫耐受而抑制自身免疫病的發(fā)生呢?Lariciresinol直接體內(nèi)注射，又如何呢?本部分研究中，我們通過小鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(

9、EAE)模型，對(duì)其抑制作用進(jìn)行了研究。
　　 以MOG35-55多肽作為抗原，輔以腹腔注射百日咳毒素，成功地建立C57BL/6小鼠的EAE模型。其中抗原肽誘導(dǎo)建立的EAE組小鼠發(fā)病率達(dá)到95％，平均臨床打分為3.16±0.79，并且該EAE模型為復(fù)發(fā)-緩解型，在疾病過程中具有間歇期和不同程度的恢復(fù)。隨后我們觀察了Lariciresinol處理的DCs對(duì)EAE誘導(dǎo)的保護(hù)效果。取培養(yǎng)至第五天的骨髓細(xì)胞來源的未成熟樹突狀細(xì)胞，8nmo

10、l/ml Lariciresinol處理24小時(shí)，用LPS刺激活化18小時(shí)后負(fù)載髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白MOG35-55抗原肽，通過腹腔注射免疫正常C57BL/6小鼠，免疫后第二天在各組小鼠中誘導(dǎo)EAE。我們發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組小鼠相比，Lariciresinol處理的DCs組小鼠的發(fā)病時(shí)間明顯推遲；發(fā)病率也明顯下降；此外，與對(duì)照組比較，臨床神經(jīng)功能評(píng)分也有所改善。以上結(jié)果都顯示，Lariciresinol處理的DCs能使EAE誘導(dǎo)的發(fā)病時(shí)間推遲

11、，降低小鼠的發(fā)病幾率，改善小鼠的臨床癥狀，對(duì)MOG35-55抗原肽誘導(dǎo)的EAE具有保護(hù)作用。為了進(jìn)一步從體內(nèi)驗(yàn)證Lariciresinol的直接作用，我們腹腔內(nèi)直接注射Lariciresinol一周后，直接誘導(dǎo)EAE發(fā)病，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Lariciresinol直接注射對(duì)EAE的抑制作用更明顯。
　　 綜上所述，我們對(duì)Lariciresinol對(duì)DCs免疫功能的調(diào)節(jié)及其機(jī)制進(jìn)行了研究。發(fā)現(xiàn)Lariciresinol通過ERKI/2和P