FasL對樹突狀細(xì)胞功能的調(diào)控及在真菌感染中的效應(yīng)研究.pdf

1、樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DC)是由Steinman和Cohn在小鼠脾臟中所發(fā)現(xiàn)的一種具有樹枝狀突起的獨(dú)特形態(tài)的細(xì)胞。DC是目前已知的最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞，它是特異性免疫應(yīng)答的觸發(fā)者，因為它能夠刺激初始型T細(xì)胞(na(i)ve T cell)活化和增殖，而M(Φ)、B細(xì)胞等只能觸發(fā)已活化的T細(xì)胞或記憶性T細(xì)胞發(fā)生免疫應(yīng)答。而且也有報道表明，活化的DC細(xì)胞能產(chǎn)生釋放大量的炎癥因子TNF-α和IL-6等。而大量炎性因子的釋放

2、促進(jìn)全身炎癥反應(yīng)綜合征的發(fā)生發(fā)展進(jìn)一步誘導(dǎo)多器官功能衰竭。故對可調(diào)控DC功能的相關(guān)分子進(jìn)行研究具有重要意義。
　　同時，細(xì)胞凋亡與固有免疫的關(guān)系仍是目前研究的熱點(diǎn)，凋亡相關(guān)分子對固有免疫的調(diào)節(jié)效應(yīng)也逐漸被人們所關(guān)注。以往研究表明，作為TNFR和TNF家族重要成員的Fas和FasL分子是經(jīng)典的凋亡誘導(dǎo)信號，但近年來的研究表明，F(xiàn)as和FasL也可以分別傳遞信號，發(fā)揮不同于凋亡誘導(dǎo)的效應(yīng)。FasL分子與Fas受體結(jié)合后，表達(dá)FasL分

3、子的細(xì)胞其自身在FasL分子反向信號的作用下發(fā)生相應(yīng)改變。相關(guān)的體內(nèi)和體外實驗也證明，F(xiàn)asL分子作為共刺激分子參與胸腺細(xì)胞成熟和成熟T細(xì)胞活化、增殖的過程，并且FasL分子，作為陽性選擇的必需分子能夠調(diào)節(jié)TCR與MHC-Ⅰ/Ⅱ類分子的親和力并提高胸腺細(xì)胞陽性選擇的效能，但其發(fā)揮效應(yīng)的具體機(jī)制尚不清楚。樹突狀細(xì)胞表面也表達(dá)FasL蛋白，但是FasL反向信號是否在DC中發(fā)揮效應(yīng)仍有待進(jìn)一步研究。
　　之前的實驗工作發(fā)現(xiàn)，活化性抗Fa

4、s抗體Jo-2不能有效誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞的凋亡，反而誘導(dǎo)DC表型和功能的成熟，并分泌釋放細(xì)胞因子IL-1β和多種趨化因子。為了深入研究FasL反向信號在DC中的非凋亡效應(yīng)，用Fas-Fc融合蛋白來模擬Fas分子的作用刺激野生型小鼠骨髓來源的樹突狀細(xì)胞(Bone marrow-derived dendritic cells，BMDC)，觀察炎癥因子的分泌、表型、吞噬能力以及抗原提呈能力的變化。初步實驗表明BMDC在Fas-Fc的作用下IL-6

5、和TNF-α分泌增加，且DC表面MHCⅡ和CD86的表達(dá)明顯上調(diào)，CD80和CD40的表達(dá)輕微上調(diào)，且DC吞噬功能輕度減弱以及抗原提呈能力一定程度上有所提升。為進(jìn)一步確認(rèn)該現(xiàn)象，用FasLgld（FasL分子胞外段分子突變致胞外結(jié)合Fas功能缺失及胞內(nèi)無法傳遞信號）小鼠進(jìn)一步驗證了FasL的反向信號對BMDC的效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)FasLgld小鼠來源的BMDC在Fas-Fc的作用下，TNF-α和IL-6的分泌減少，抗原提呈能力降低。為了進(jìn)一步確

6、認(rèn)該現(xiàn)象，利用了FasLΔIntra小鼠（FasL分子胞外段能結(jié)合并觸發(fā)Fas信號，但FasL分子胞內(nèi)段突變不能有效激活下游信號通路），結(jié)果基本與FasLgld小鼠相一致。而且進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，野生型小鼠來源的BMDC在某些MAPK通路抑制劑和Fas-Fc的共同作用下，TNF-α和IL-6的分泌減少，這說明FasL胞內(nèi)信號促進(jìn)DC分泌炎癥因子，并且這一效應(yīng)與MAPK通路相關(guān)，Western blot結(jié)果也進(jìn)一步驗證了這一現(xiàn)象。由于TNF-

7、α和IL-6的分泌與多種疾病如自身免疫性疾病及感染性疾病相關(guān)，因此，研究FasL的反向信號對其分泌的影響及機(jī)制，將進(jìn)一步加深人們對自身免疫疾病及炎癥等疾病的發(fā)生發(fā)展的認(rèn)識，為尋找這些疾病的治療方案提供新思路。
　　另一方面，知道FasL分子反向信號能誘導(dǎo)炎癥因子的大量釋放，而炎癥因子的大量釋放是系統(tǒng)性感染的重要特征。因此，想知道FasL反向信號在系統(tǒng)性感染過程中發(fā)揮怎樣的效用。建立了真菌系統(tǒng)性感染模型，將一定量的白色念珠菌通過尾靜

8、脈分別注入WT、FasLgld、FasLΔIntra小鼠體內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FasLgld小鼠總體生存率提高，在感染48h后肝、腎真菌負(fù)荷量減少;同樣地，F(xiàn)asLΔIntra小鼠對真菌感染也不敏感，其生存期明顯延長，并且血清中的IL-6和TNF-α的釋放顯著降低，且感染48h后，F(xiàn)asLΔIntra小鼠腎臟的真菌負(fù)荷量顯著減少。這一系列結(jié)果提示FasL反向信號的活化可能與真菌系統(tǒng)性感染導(dǎo)致的炎癥損害及預(yù)后相關(guān)。已知重要的模式識別受體Toll樣

9、受體(Toll-like receptors，TLR)和C型凝集素型受體(C-type lectin receptors，CLR)在識別細(xì)菌和真菌并誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的過程中發(fā)揮重要作用，而大量研究表明CLR能夠結(jié)合大多數(shù)真菌細(xì)胞壁暴露的β-葡聚糖或甘露糖等配體分子，在抗真菌感染免疫中發(fā)揮主要作用。CLR，包括dectin-1，dectin-2，甘露糖受體，DC-SIGN和Mincle等在內(nèi)能夠識別結(jié)合真菌的多糖，誘導(dǎo)DC分泌TNFα、IL-

10、1β、IL-6和IL-23以及趨化因子CCL2、CXCL1及CCL3。而之前的實驗結(jié)果也表明FasL分子突變后的小鼠對于系統(tǒng)性真菌感染不敏感，炎癥因子釋放減少，這也提示FasL反向信號可能與CLR信號傳導(dǎo)通路存在相互影響。為了驗證DC的FasL效應(yīng)在抗真菌感染反應(yīng)中的作用，進(jìn)一步研究DC中FasL與CLR的交互作用，通過體外培養(yǎng)WT、FasLΔIntra小鼠來源的BMDC，分別給予2μg/ml的zymd（dectin-1激活劑）、2μg

11、/ml的mannan（dectin-2激活劑）刺激DC24h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FasLΔIntra來源的BMDCIL-6和TNF-α的分泌量顯著降低;同樣地，用Fas-Fc刺激WT和CLR缺陷小鼠（dectin-1-/-和dectin-2-/-小鼠）來源的BMDC，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CLR缺陷小鼠IL-6、TNF-α因子分泌減少。這也進(jìn)一步驗證了FasL與CLR存在交互作用，但其分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
　　綜上所述，F(xiàn)asL分子反向信號通過多條經(jīng)