葡萄根系產褪黑素內生細菌的篩選及其合成路徑的研究.pdf

1、褪黑素(Melatonin，MEL)是一種動植物和單細胞生物中普遍具有的色氨酸衍生物，它擁有獨特的抗氧化和生理調節(jié)的功能。外源應用MEL能夠促進植物種子發(fā)芽，根系發(fā)育、開花以及果實成熟，同時也能防止葉片衰老，在生物和非生物逆境脅迫下提高植物的耐受能力。前人的研究表明，非生物脅迫能夠提高植物內源MEL的合成，這是由于逆境脅迫下植物產生的活性氧類物質(Reactive oxygen species;ROS)激活了植物MEL的生物合成。在自然

2、條件下，陸地植物的根系聚集著豐富的內生微生物，它們能夠與宿主植物互相作用，并調節(jié)植物的生長和發(fā)育。內生菌是植物生長發(fā)育的根系有益組分，它們往往具有合成植物激素的能力，并能夠改變宿主的內源激素水平;然而，目前還沒有證據表明內生菌能夠合成MEL，并且憑此能力，影響宿主植物的生理代謝。本研究從不同葡萄品種的根系內分離、鑒定得到多種內生細菌，隨后篩選出具有MEL合成能力的菌株。以高產MEL的菌株為材料，研究其對宿主植物逆境脅迫下內源MEL水平和

3、生長發(fā)育的影響;通過15N穩(wěn)定同位素標記技術，探討內生細菌MEL生物合成路徑;采用原核表達和基因敲除手段，驗證參與細菌MEL合成的L-苯丙氨酸羥化酶功能。主要研究結果如下:
　　(1)采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)的方式并結合16S rDNA測序，從‘赤霞珠’，‘紅地球’，‘夏黑’以及中國野生山葡萄‘長白九號’根系中分離內生細菌，并對優(yōu)勢菌進行培養(yǎng)，結合UPLC-MS/MS技術測定菌株MEL的產生能力。結果顯示:4個葡萄品種根系中共分離得到內生

4、細菌6個屬，15個種;檢測到5株細菌具有MEL合成能力，分別為Bacillus amyloliquefaciens SB-9,Bacillus thuringiensis CS-9,Pseudomonas fluorescens RG11,Agrobacterium tumefaciens CS-30和Variovorax soli VA10，MEL合成能力在0.15-7.75ng/1012cells之間。
　　(2)選取MEL合

5、成能力最強的內生菌解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)SB-9和熒光假單胞桿菌(Pseudomonas fluorescens)RG11侵染不同葡萄品種幼苗根系，結果顯示，B.amyloliquefaciens SB-9和P.fluorescens RG11侵染葡萄幼苗顯著提高植株的鮮重，葉綠素含量，根長度和側根數量等生長指標，表現(xiàn)出優(yōu)良的生長促進作用;此外，在葡萄幼苗經受干旱或者鹽脅迫時，B.amyl

6、oliquefaciens SB-9和P.fluorescens RG11根系定殖顯著提高內源MEL及其前體物的含量，降低葡萄色氨酸脫羧酶基因（VvTDCs）和5-羥色胺N-乙酰轉移酶(VvSNAT)的轉錄水平;同時通過減少根系內丙二醛(MDA)和活性氧的產生，抵御鹽和干旱脅迫帶來的不利影響。
　　(3)采用15N穩(wěn)定同位素標記技術，研究產MEL內生細菌P.fluorescens RG11的MEL合成中間代謝產物組成以及合成規(guī)律。

7、結果顯示，除了15N-色胺以外，菌液中檢測到15N-5-羥色氨酸、15N-5-羥色胺、15N-N-乙酰-5-羥色胺以及15N-MEL的產生，表明此菌株MEL的合成途徑與動物中相似，MEL合成的第一步反應是15N-L-色氨酸碳骨架被羥化形成5-羥色氨酸，推測細菌苯丙氨酸羥化酶(PAH)可能負責此菌株的色氨酸的羥基化;此外，P.fluorescens RG11的MEL合成能力在生長期前期最高，培養(yǎng)后期急劇下降，推測MEL在細菌中可能是作為生

8、長信號因子或作為保護因子用于清除培養(yǎng)基中的ROS，以促進細菌生長早期的適應性。
　　(4)分析原核細菌苯丙氨酸羥化酶(PAH)與動物氨基酸羥化酶（AAAHs）家族的親緣關系，同時克隆得到P.fluorescens RG11的PAH編碼基因，原核表達得到此菌株的PAH蛋白，通過酶活分析，在體外迸一步研究PAH對L-色氨酸的羥化能力，結果顯示:P.fluorescens RG11中PAH蛋白與動物AAAHs家族蛋白存在較高的氨基酸序列

9、相似性;體外酶活測試表明，純化的重組PAH蛋白同時具有L-色氨酸和L-苯丙氨酸羥化酶活性，能夠將L-色氨酸羥基化為5-羥基色氨酸，Km和Vmax值分別為2575μM和0.834μmol5-羥基色氨酸/min/mg蛋白，然而對L-色氨酸的親和力和羥化活力明顯低于羥化L-苯丙氨酸。
　　(5)通過同源重組技術，將P.fluorescens RG11控制合成PAH蛋白的phhA基因敲除，構建ΔPhhA敲除菌株，隨后采用15N同位素示蹤法