隱球菌腦膜炎小鼠腦組織CD44表達研究.pdf

1、
　　 新生隱球菌是一種嚴重危害人類健康的醫(yī)學真菌，隱球菌病發(fā)病率逐年增加，其中90％侵犯中樞神經系統(tǒng)，引起致命性的腦膜腦炎。新生隱球菌侵犯中樞神經系統(tǒng)的機制和治療的研究受到高度重視。
　　 隱球菌感染中樞神經系統(tǒng)的前提是必須通過血腦屏障。目前，國內外學者圍繞隱球菌與腦血管內皮細胞相互作用方面做了大量的研究，發(fā)現(xiàn)了隱球菌通過胞吞胞吐等方式穿越腦血管內皮細胞。
　　 最新的研究顯示，在隱球菌感染腦血管內皮細胞過程中

2、，菌體莢膜透明質酸HA與宿主CD44相互作用，促進隱球菌侵襲宿主細胞和細胞骨架重組。易于菌體穿越腦血管內皮細胞。CD44在隱球菌感染宿主過程中發(fā)揮重要作用。
　　 研究發(fā)現(xiàn)，CD44是分布極為廣泛的細胞表面跨膜糖蛋白，屬于未分類的粘附分子。CD44作為細胞表面的黏著性受體，與許多疾病的進展和轉歸都有密切的關系，甚至能成為多種疾病治療的靶點。
　　 目前，國內外學者研究隱球菌穿越血腦屏障感染中樞神經系統(tǒng)的機制主要集中在細胞

3、水平上，在動物模型上的研究報道較少。
　　 本研究組已經成功建立隱球菌腦膜炎小鼠模型。在此基礎上，已經開展了多項關于隱球菌腦膜炎的發(fā)病機制的課題研究，分析了新生隱球菌中樞神經系統(tǒng)感染動物模型腦組織含水量的變化規(guī)律。發(fā)現(xiàn)AQP4蛋白在調節(jié)隱球菌腦膜炎腦內水液平衡中發(fā)揮重要作用。為進一步研究探索隱球菌腦膜炎的發(fā)病機制打下良好的基礎。我們擬在動物模型上研究隱球菌與小鼠作用前后CD44的表達變化，闡明CD44是隱球菌腦膜炎發(fā)生的重要分子

4、。利用現(xiàn)代分子生物學技術在分子水平上研究隱球菌與宿主的相互作用已經非常成熟。我們應用RT-PCR技術、Western-blotting技術和免疫組化技術檢測隱球菌腦膜炎小鼠腦組織CD44表達，闡明小鼠腦組織CD44表達與隱球菌腦膜炎發(fā)病的相互聯(lián)系，說明CD44在隱球菌腦膜炎的發(fā)病中發(fā)揮重要作用。探索和闡明隱球菌腦膜炎的可能的發(fā)病機制，為本病的預防和治療指明新的方向。
　　 目的：
　　 1、應用RT-PCR技術、West

5、ern blotting和免疫組化技術測定隱球菌腦膜炎小鼠腦組織中CD44表達；
　　 2、闡明CD44與隱球菌腦膜炎發(fā)生的關系，探索隱球菌腦膜炎可能的發(fā)病機制。
　　 方法：
　　 第一部分：
　　 1、隱球菌腦膜炎小鼠腦組織標本從-70℃冰箱取出備用。
　　 2、將各組組織轉移至12×55mmm試管中，勻漿后，經異丙醇，75％乙醇，20ulDEPC處理水處理，抽提組織RNA。
　　 3

6、、將經過稀釋后的RNA樣本，加入逆轉錄酶MMLV1ul，oligo(d T0.5 ul，dNTPs0.5ul，5×逆轉錄buffer4ul，DEPC處理水10ul反應，制備逆轉錄cDNA。
　　 4、將制備好cDNA2ul加入SYBRGreen Mix32.5ul，上游引物F0.5ul，下游引物R0.5ul，ddH2O水14.5ul，進行PCR擴增。
　　 第二部分：
　　 1、隱球菌腦膜炎小鼠腦組織標本從-70

7、℃冰箱取出備用。
　　 2、將稱取各樣本冰浴條件下勻漿；13200rpm離心，取上清液，-80℃保存。
　　 3、樣品采用10倍稀釋，求得在20μl總體積中的樣品體積，每個樣品上樣量為40μg。
　　 4、將分裝好的樣品經過SDS-PAGE電泳、轉膜及封閉、然后加入一抗和二抗作用、ECL顯色后，放入定影液顯影定影。檢測腦CD44的表達。
　　 第三部分：
　　 1、隱球菌腦膜炎小鼠腦組織標本及正常

8、小鼠腦組織從-70℃冰箱取出備用。
　　 2、免疫組化染色：將各組標本取出制作石蠟切片，常規(guī)脫蠟脫水，加入一抗和二抗以及顯色液，進行免疫組織化學顯色。
　　 3、封片后鏡下觀察切片結果，最后拍攝照片。
　　 結果：
　　 第一部分：隱球菌腦膜炎小鼠腦組織CD44的mRNA在12h的mRNA表達水平與對照組，48h,4d,7d組相比較升高，有統(tǒng)計學意義。(p＜0.05)，其它時間點小鼠腦組織mRNA表達兩兩

9、比較沒有顯著變化。
　　 第二部分：
　　 隱球菌腦膜炎小鼠腦組織CD44試驗組各時間點蛋白表達與對照組相比無顯著變化(p＞0.05)，沒有統(tǒng)計學意義。
　　 第三部分：
　　 試驗結果表明對照組小鼠腦組織CD44均勻分布在腦細胞膜上。實驗組中隱球菌作用小鼠6h,12h后，小鼠腦組織CD44的分布沒有明顯變化，作用24h后，隱球菌誘導腦組織CD44向腦組織的一側移行，作用48h,72h后，CD44的分布發(fā)

10、生了明顯變化，在隱球菌腦膜炎腦膜側的腦組織分布大量的CD44，而在腦實質側CD44的分布明顯減少。更重要的是在病灶周圍的腦組織CD44分布也觀察到一側增加，另一側分布減少。
　　 結論：
　　 1、隱球菌腦膜炎小鼠腦組織試驗組CD44的mRNA水平表達出現(xiàn)短暫性增高。隱球菌腦膜炎小鼠試驗組CD44蛋白表達與對照組沒有發(fā)生顯著的變化。
　　 2、隱球菌侵入小鼠大腦后，隱球菌誘導CD44向腦組織的一側移行，向腦膜方向