孝順竹遺傳多樣性、再生體系構(gòu)建及雜交育種研究.pdf

1、為探索竹類(lèi)植物的遺傳改良技術(shù)，選擇叢生竹中分布較廣、適應(yīng)性較強(qiáng)的孝順竹（Bambusa multiplex）為材料，開(kāi)展了地理居群表型性狀變異的調(diào)查分析，基于AFLP標(biāo)記的遺傳多樣性分析，開(kāi)花生物學(xué)特性研究和雜交試驗(yàn)，以及不同外植體類(lèi)型的愈傷組織再生技術(shù)研究。主要獲得以下研究結(jié)果：
　　1.對(duì)孝順竹自然分布區(qū)內(nèi)5個(gè)天然地理居群開(kāi)展胸徑、地徑、全長(zhǎng)等19個(gè)表型性狀調(diào)查和統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)居群間和居群內(nèi)存在豐富的表型變異。19個(gè)表型性狀在

2、5個(gè)居群間的差異均達(dá)極顯著或顯著差異，瀘州居群有14個(gè)表型性狀的均值具5個(gè)居群之首，而仁化居群有11個(gè)性狀的表型均值具5個(gè)居群之末。相關(guān)分析表明，胸徑、地徑、胸徑/地徑等14個(gè)表型性狀間相關(guān)性均達(dá)到極顯著或顯著水平；僅稈節(jié)數(shù)、稈節(jié)數(shù)/全節(jié)數(shù)、葉長(zhǎng)、葉寬、葉長(zhǎng)/寬等5個(gè)性狀與其它性狀間的相關(guān)性較弱。表型性狀與地理生態(tài)因子間的相關(guān)系數(shù)顯示，稈重/全重與緯度、葉長(zhǎng)/寬與海拔呈顯著性正相關(guān)，葉長(zhǎng)與經(jīng)度、葉長(zhǎng)/寬與經(jīng)度、稈節(jié)數(shù)/全節(jié)數(shù)與緯度等分別

3、呈顯著性負(fù)相關(guān)。表型性狀主成分分析的結(jié)果可獲得3個(gè)主成分，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)97.435％。第一主成分以胸徑、地徑、全長(zhǎng)等8個(gè)性狀的權(quán)重較大；第二主成分以葉長(zhǎng)/寬的作用最大；第三主成分以稈節(jié)數(shù)、稈節(jié)數(shù)/全節(jié)數(shù)權(quán)重較大。將主成分分析的結(jié)果代入群體平均值開(kāi)展系統(tǒng)聚類(lèi)，可以從表型上將5個(gè)居群劃分為3類(lèi)，即溫嶺居群首先與長(zhǎng)汀居群聚為一類(lèi)，龍山居群與仁化居群聚為一類(lèi)，瀘州居群?jiǎn)为?dú)一類(lèi)。
　　2.從56對(duì)AFLP引物中篩選出10對(duì)較好的引物用于5個(gè)

4、孝順竹居群150個(gè)樣品的PCR擴(kuò)增，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明：10對(duì)引物在5個(gè)居群中共檢測(cè)到939個(gè)位點(diǎn)，多態(tài)性位點(diǎn)比率71.99%。5個(gè)孝順竹居群內(nèi)檢測(cè)到的多態(tài)位點(diǎn)數(shù)A在106－464之間，平均為255.8個(gè)；多態(tài)位點(diǎn)百分率P在11.29%－49.41％之間，平均為27.24％；觀測(cè)等位基因數(shù)na在1.1129－1.4941之間；有效等位基因數(shù)ne在1.0713－1.3147之間；Nei’s基因多樣性指數(shù)h在0.0406－0.1794之間；S

5、hannon信息指數(shù)I在0.0601－0.2656之間；多態(tài)位點(diǎn)數(shù)A、多態(tài)位點(diǎn)百分率P、等位基因數(shù)na、有效等位基因數(shù)n、Nei’s基因多樣性指數(shù)h、Shannon信息指數(shù)I的等指標(biāo)在5個(gè)居群間的排序均表現(xiàn)為長(zhǎng)?。救驶緶貛X＞瀘州＞龍山，表明長(zhǎng)汀居群存在豐富的遺傳變異，而龍山居群的遺傳多樣性相對(duì)較低。孝順竹物種水平遺傳分化系數(shù)Gst=0.4393，即孝順竹群體間的遺傳變異占總變異的43.93%，群體內(nèi)的遺傳變異占總變異的56.07％；居

6、群間基因流Nm=0.6383。5個(gè)孝順竹居群間的遺傳一致度在0.8165－0.9675之間，遺傳距離在0.0330－0.2027之間，利用遺傳距離采用UPGMA法對(duì)5個(gè)孝順竹地理居群進(jìn)行聚類(lèi)的結(jié)果顯示，瀘州居群內(nèi)和龍山居群最先聚在一起，然后與溫嶺居群相聚，長(zhǎng)汀居群最后聚在一起。
　　3.孝順竹開(kāi)花生物學(xué)和雜交試驗(yàn)表明，孝順竹常于4月份形成花序，小花在早晨至上午開(kāi)放，下午14：00－15：00陸續(xù)閉合；花絲伸長(zhǎng)生長(zhǎng)結(jié)束時(shí)花粉生活力最

7、高，萌發(fā)率可達(dá)50％以上；稃片完全張開(kāi)時(shí)柱頭可授性較強(qiáng)，上午9：00－12：00柱頭可授性較好。孝順竹種內(nèi)自交授粉、及其與麻竹的雜交試驗(yàn)表明，孝順竹自交種實(shí)與雜交種實(shí)未表現(xiàn)出明顯區(qū)別，均為長(zhǎng)橢圓形，有不甚明顯的腹溝，具喙，成熟時(shí)黃褐色。成熟的孝順竹種子純凈種子長(zhǎng)0.82-1.10 cm，寬0.26-0.28 cm，百粒鮮重3.32 g。孝順竹×麻竹雜交苗在四個(gè)月齡時(shí)即表現(xiàn)出與母本自交苗明顯的差異，葉片明顯大于后者，此時(shí)表型雜種的葉長(zhǎng)、葉

8、寬、葉長(zhǎng)/寬、地徑、發(fā)筍數(shù)、葉脈數(shù)、葉片形狀、葉鞘高度、葉鞘繸毛、葉耳、葉舌等性狀均介于母本和父本自交個(gè)體之間。對(duì)表型雜種開(kāi)展AFLP分子標(biāo)記鑒定，10株表型雜種中父本特異位點(diǎn)占21.97%－28.10%，非親本位點(diǎn)占1.88%－4.05％，表明雜種引入了父本的遺傳基礎(chǔ)且進(jìn)行了遺傳重組。雜種稈籜在15個(gè)月齡時(shí)表現(xiàn)出刺毛性狀的分離，一種為父本的多刺毛表型，一種為母本的光滑稈籜。孝順竹開(kāi)花生物學(xué)的研究和種間雜種的獲得為實(shí)現(xiàn)叢生竹重要性狀的遺

9、傳學(xué)分析和新品種選育奠定了基礎(chǔ)。
　　4.利用孝順竹小穗和種胚外植體誘導(dǎo)出胚性愈傷組織并實(shí)現(xiàn)植株再生。適宜愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基組成為NB＋500 mg·L-1脯氨酸＋500 mg·L-1谷氨酰胺＋300 mg·L-1水解酪蛋白＋30 g·L-1蔗糖＋8 g·L-1卡拉膠＋4 mg·L-12,4-D的培養(yǎng)基上，小穗和種胚愈傷組織誘導(dǎo)率分別可達(dá)87.30%、76.27%。對(duì)愈傷組織增殖的培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，較好的培養(yǎng)基組成為KNO347

10、5 mg.L-1+ NH4NO3825 mg.L-1+MgSO4·7H2O185 mg.L-1+ KH2PO4340 mg.L-1+CaCl2·7H2O440 mg.L-1＋MS basal micronutrients+MS Iron+MS vitamins＋1.0 mg.L-1 proline+30 g.L-1 maltose+8 g.L-1carrageenan+4 mg.L-12,4-D，部分愈傷組織可耐10.0 g.L-1 N

11、aCl脅迫，75 mg.L-1的潮霉素可用于愈傷組織的抗性篩選。懸浮培養(yǎng)時(shí)，接種細(xì)胞密度以4.0％為宜，轉(zhuǎn)速設(shè)120 r/min較好，2,4-D濃度4～6 mg·L-1，7-10d為轉(zhuǎn)接周期較佳。植株分化過(guò)程經(jīng)歷預(yù)分化轉(zhuǎn)綠和發(fā)芽?jī)蓚€(gè)階段，經(jīng)MS＋30 g·L-1蔗糖＋10 g·L-1卡拉膠＋4 mg·L-1 KT培養(yǎng)基預(yù)分化7 d后，轉(zhuǎn)入無(wú)激素的MS培養(yǎng)基上分化14 d，小穗愈傷組織僅個(gè)別長(zhǎng)出綠色芽頭；但種胚愈傷組織芽分化率可達(dá)80.0