新型甲型H1N1-季節(jié)性流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑評(píng)價(jià)體系的建立與藥物篩選.pdf

1、流感病毒(Influenza Virus)表面糖蛋白神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase,NA)在其生命周期中起重要作用,主要作用為促進(jìn)子代流感病毒顆粒從宿主細(xì)胞釋放。本文以2009年出現(xiàn)的新型甲型H1N1流感病毒[A/California/04/2009(H1N1),簡(jiǎn)稱CA/04]及一株普通流感病毒[A/Puerto Rico/8/34(H1N1),簡(jiǎn)稱PR/8]的神經(jīng)氨酸酶為靶點(diǎn),建立野生型與達(dá)菲耐藥型(CA/04:H275Y/

2、N295S/E119V/R293K；PR/8:H260Y/N280S/E104V/R278K)酶學(xué)水平與細(xì)胞水平藥物評(píng)價(jià)體系。
　　 酶學(xué)水平評(píng)價(jià)模型是將表達(dá)NA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,表達(dá)后直接裂解細(xì)胞作為NA酶原液,與化合物作用后加入NA特異性底物4-MUNANA并溫孵,通過熒光檢測(cè)法測(cè)定其產(chǎn)物4-MU的生成量來反映化合物對(duì)NA的抑制作用。細(xì)胞水平評(píng)價(jià)模型應(yīng)用重組病毒技術(shù),將表達(dá)流感病毒血凝素蛋白(Hemagglutinin

3、,HA)[A/VietNam/1203/2004(H5N1)]的質(zhì)粒、表達(dá)NA的質(zhì)粒以及表達(dá)敲除外殼基因并帶有熒光素酶報(bào)告基因的HIV-1基因組共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞,產(chǎn)生以HA、NA為外殼蛋白包裹HIV-1核心的重組病毒；在病毒釋放環(huán)節(jié)前加入不同濃度的化合物后,收集病毒上清感染A549細(xì)胞,通過測(cè)定熒光素酶活性計(jì)算病毒感染率來反映病毒釋放量,從而反映出化合物對(duì)重組病毒NA的抑制作用。
　　 模型經(jīng)用陽(yáng)性藥物達(dá)菲及其羧酸活性形式以

4、及扎那米韋驗(yàn)證,結(jié)果顯示:對(duì)于NA(CA/04)及其耐藥株,酶學(xué)水平模型達(dá)菲羧酸和扎那米韋對(duì)NA(CA/04)-wild type的IC50分別為1.04±0.043 nmol·L-1和0.368±0.042 nmol·L-1,對(duì)NA(CA/04)-H275Y的IC50分別為173±51.3 nmol·L-1和0.263±0.194 nmol·L-1,對(duì)NA(CA/04)-N295S的IC50分別為80.4±10.4 nmol·L-1和

5、1.71±0.650 nmol·L-1,對(duì)NA(CA/04)-E119V的IC50分別為78.4±23.3 nmol·L-1和116±41.5 nmol·L-1,R293K突變型不具備建立藥模型的條件；細(xì)胞水平模型中三種藥物對(duì)NA(CA/04)-wild type的IC50分別為50.9±30.0 nmol·L-1、5.31±1.76 nmol·L-1和4.17±2.42 nmol·L-1,對(duì)NA(CA/04)-H275Y的IC50分別

6、為2737±2250 nmol·L-1、248±165 nmol·-L-1和1.64±0.962 nmol·L-1,對(duì)NA(CA/04)-N295S的IC50分別為3957±1639 nmol·L-1、258±171nmol·L-1和3.00±2.24 nmol·L-1,對(duì)NA(CA/04)-E119V的IC50分別為804±207nmol·L-1、70.3±34.0 nmol·L-1和53.7±8.70 nmol·L-1,R293K突

7、變型不具備建立藥模型的條件；對(duì)于NA(PR/8)及其耐藥株,酶學(xué)水平模型達(dá)菲羧酸和扎那米韋對(duì)NA(PR/8)-wild type的IC50分別為1.34±0.731 nmol·L-1和0.584±0.142 nmol·L-1,對(duì)NA(PR/8)-H260Y的IC50分別為181±35.0 nmol·L-1和0.607±0.312 nmol·L-1,對(duì)NA(PR/8)-N280S的IC50分別64.7±19.0 nmol·L-1和1.52

8、±0.489 nmolL-1,E104V和R278K不具備建立藥模型的條件；細(xì)胞水平模型三種藥物對(duì)NA(PR/8)-wild type的IC50分別為8.96±5.29 nmol·L-1、0.616±0.229 nmol·L-1和0.495±0.384 nmol·L-1,對(duì)NA(PR/8)-H260Y的IC50分別為6257±2087 nmol·L-1、298±47.1 nmol·L-1和0.529±0.266 nmol·L-1,對(duì)NA

9、(PR/8)-N280S的IC50分別為650±65.4 nmol·L-1、40.3±35.4nmol·L-1和0.760±0.215 nmol·L-1,E104V和R278K突變型不具備建立藥模型的條件。所得結(jié)果與已有文獻(xiàn)報(bào)道相符。
　　 本文應(yīng)用模型對(duì)約1500個(gè)化合物和14種中藥組分進(jìn)行了初篩評(píng)價(jià),得到11個(gè)活性化合物,半數(shù)抑制濃度均小于100μmol·L-1。
　　 綜上所述,本研究系統(tǒng)建立了以甲型流感病毒NA為