楊樹莖木質(zhì)素的RNAi調(diào)控及糖化特性分析.pdf

1、隨著人們對(duì)環(huán)境質(zhì)量和生活品質(zhì)的重視以及保障能源安全的需求，生物質(zhì)能源越來(lái)越受到公眾和科學(xué)界的關(guān)注。考慮到生物柴油生產(chǎn)的高成本，生物乙醇成為全球最廣泛利用的生物燃料。但由于目前生產(chǎn)生物乙醇的原料主要來(lái)自于谷物等糧食作物，由此牽涉到到全球糧價(jià)上漲和糧食恐慌，加之其有限的能源產(chǎn)量，使得通過(guò)糧食發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇的規(guī)模化發(fā)展受到限制。在保證糧食安全的前提下解決能源危機(jī)問(wèn)題，必然聚焦于林木生物質(zhì)能源。木質(zhì)纖維素是地球上數(shù)量最大的一種可再生資源，發(fā)展

2、經(jīng)濟(jì)有效而環(huán)境友好的木質(zhì)纖維素燃料乙醇技術(shù)，已成為世界生物能源科技發(fā)展的趨勢(shì)。針對(duì)我國(guó)國(guó)情，發(fā)展以木質(zhì)纖維生物轉(zhuǎn)化乙醇為重點(diǎn)的生物能源技術(shù)，建立以能源林業(yè)為依托的原料保障模式，可以實(shí)現(xiàn)“不與人爭(zhēng)糧”、“不與糧爭(zhēng)地”的目的，兼得經(jīng)濟(jì)、生態(tài)、環(huán)保、社會(huì)多重效益。作為木本模式植物的楊樹是全球廣泛栽培的重要造林樹種之一，我國(guó)楊樹資源豐富，是世界上人工林面積最大的國(guó)家。楊樹分布廣、實(shí)用性強(qiáng)、無(wú)性繁殖能力強(qiáng)，加之其速生豐產(chǎn)、遺傳背景清楚等優(yōu)勢(shì)，無(wú)可

3、爭(zhēng)議地成為林木生物質(zhì)能源研究的首選。林木生物質(zhì)能源發(fā)展面臨的最大技術(shù)難題是木質(zhì)纖維素的水解。由于木質(zhì)素與纖維素的緊密結(jié)合和對(duì)其保護(hù)作用是導(dǎo)致纖維素資源利用的主要障礙。降低木質(zhì)素含量或改變其結(jié)構(gòu)，將有利于纖維素的解聚和糖轉(zhuǎn)化效率的提高。
　　本研究根據(jù)前人研究成果，選定毛白楊香豆酰莽草酸/奎寧酸羥化酶C3H、肉桂酸-4-羥基化酶C4H和羥基肉桂酰輔酶A：莽草酸/奎尼酸羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶HCT基因?yàn)檎{(diào)控目標(biāo)，通過(guò)RT-PCR的方法得到毛

4、白楊C3H1、C4H1、HCT1和HCQ3基因的cDNA全長(zhǎng)序列，C3H1基因的cDNA完整的開(kāi)放讀碼框（ORF）共編碼508個(gè)氨基酸，HCT1編碼432個(gè)氨基酸，HCQ3編碼431個(gè)氨基酸，C4H1基因編碼505個(gè)氨基酸。依此為基礎(chǔ)構(gòu)建了毛白楊 C3H1、C4H1、HCT1和HCQ3基因的RNAi抑制表達(dá)載體pBIRNAi-C3H1R-i-C3H1L、pBIRNAi-C4H1R-i-C4H1L、pBIRNAi-HCT1R-i-HCT1

5、L和pBIRNAi-HCQ3R-i-HCQ3L。進(jìn)一步利用Gateway技術(shù)和已構(gòu)建的RNAi抑制表達(dá)載體，構(gòu)建了含有毛白楊C3H1、C4H1、HCT1和HCQ3基因多基因不同組合發(fā)夾結(jié)構(gòu)的共15個(gè)RNAi抑制表達(dá)載體，以用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的楊樹遺傳轉(zhuǎn)化。
　　通過(guò)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化銀腺楊無(wú)性系84K，經(jīng)農(nóng)桿菌培養(yǎng)、侵染、共培養(yǎng)、選擇培養(yǎng)、繼代選擇培養(yǎng)和生根培養(yǎng)后獲得轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株。經(jīng)NPT-II基因和目標(biāo)基因片段的PCR鑒定

6、后移栽溫室，經(jīng)低溫誘導(dǎo)后溫室扦插繁殖，最終獲得轉(zhuǎn)C3H1基因RNAi抑制表達(dá)載體pBIRNAi-C3H1R-i-C3H1L共8個(gè)株系25個(gè)單株、轉(zhuǎn)HCT1基因RNAi抑制表達(dá)載體pBIRNAi-HCT1R-i-HCT1L的15個(gè)株系33個(gè)單株和轉(zhuǎn)HCQ3基因RNAi抑制表達(dá)載體pBIRNAi-HCQ3R-i-HCQ3L的7個(gè)株系25個(gè)單株。
　　扦插繁殖后的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株和對(duì)照植株新萌枝條通過(guò)Realtime PCR檢測(cè)目標(biāo)基因轉(zhuǎn)

7、錄表達(dá)量，轉(zhuǎn)基因株系323、325和322中C3H1基因表達(dá)量較野生型植株分別下調(diào)了89.04％、82.22%和68.38%，312、308、502和307各株系HCQ3基因轉(zhuǎn)錄量比野生型植株的平均表達(dá)量下調(diào)了67.64%、56.35%、49.88%和45.05%。
　　莖橫切片組化染色和顯微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果表明，基因表達(dá)受抑制的轉(zhuǎn)基因植株次生木質(zhì)部細(xì)胞層數(shù)增多，細(xì)胞較小，導(dǎo)管壁塌陷和部分細(xì)胞次生壁的不規(guī)則區(qū)域性加厚，反映出轉(zhuǎn)基因植株

8、木質(zhì)部發(fā)育和木質(zhì)素沉積方式發(fā)生了改變。
　　木質(zhì)素、纖維素含量測(cè)定結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株木質(zhì)素含量的降低與目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量下調(diào)總體相符，木質(zhì)素降低的轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出較高的纖維素含量，C3H1轉(zhuǎn)基因植株木質(zhì)素含量平均降低23.00%，最高降低了39.71%；HCQ3轉(zhuǎn)基因植株木質(zhì)素含量平均降低了37.65%，最高達(dá)58.19%。苯酚-硫酸法總糖含量、糖轉(zhuǎn)化效率測(cè)定與 HPLC法可溶性總糖、單糖含量檢測(cè)結(jié)果表明，木質(zhì)素含量的降低可導(dǎo)

9、致細(xì)胞可溶性糖含量的增加及纖維素的糖轉(zhuǎn)化效率的提高。C3H1和HCQ3轉(zhuǎn)基因植株酸前處理效率較對(duì)照平均提高了62.41%和119.18%，酸前處理后酶解效率最高提高了51.74%；說(shuō)明由于木質(zhì)素含量的降低可能引發(fā)了細(xì)胞中可溶性糖和纖維素的代償性增加，同時(shí)由于木質(zhì)素的減少，減輕了對(duì)纖維素的束縛作用，游離的纖維素增多，纖維素復(fù)合酶對(duì)纖維素的可及度增大，使得酶解糖化效率顯著提高。未經(jīng)酸前處理的轉(zhuǎn)基因植株糖化效率明顯高于對(duì)照植株，甚至達(dá)到或高于