跨膜型TNF-α對(duì)急性肝衰與內(nèi)毒素性休克的影響.pdf

1、跨膜型TNF-a(Transmembrane tumor necrosis factor, tmTNF-a)是分泌型TNF-a(Secreted TNF-a，sTNF-a)前體，在TNF-a轉(zhuǎn)換酶處理后，釋放其胞外端而成為sTNF-a。兩型TNF-a均具有生物學(xué)功能。sTNF-a是典型的促炎細(xì)胞因子，在急性肝衰和內(nèi)毒素性休克發(fā)病機(jī)制中扮演著關(guān)鍵作用；然而，tmTNF-a在這兩種疾病中的作用雖然有轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)報(bào)道，但轉(zhuǎn)染的是缺失酶切位

2、點(diǎn)的tmTNF-a突變體。前期工作證實(shí)該突變體與野生型分子在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)上有明顯差異，且不同實(shí)驗(yàn)室報(bào)道結(jié)果相反。鑒于這些報(bào)道可能不能反映天然tmTNF-a在這2種疾病中的作用，本研究旨在觀(guān)察內(nèi)源性tmTNF-a對(duì)急性鼠肝衰及內(nèi)毒素性休克的影響，并探索其作用機(jī)制。主要結(jié)果如下：
　　第一部分 跨膜型TNF-a對(duì)急性肝衰的影響
　　一、肝組織損傷變化特點(diǎn)
　　給小鼠注射LPS/D-gal制備急性肝衰模型，HE染色結(jié)果顯示，注射

3、后2h可見(jiàn)肝細(xì)胞呈輕度水腫，4h肝細(xì)胞水腫，并有少量灶狀壞死，6h可見(jiàn)肝竇淤血，肝細(xì)胞壞死，肝細(xì)胞索斷裂；血清ALT和 AST直至LPS/D-gal處理后6h才顯著升高，提示這個(gè)時(shí)間點(diǎn)肝組織明顯受損。
　　二、急性肝衰內(nèi)源性sTNF-a與tmTNF-a表達(dá)的變化與肝組織損傷的相關(guān)性
　　1. sTNF-a變化特點(diǎn)：ELISA結(jié)果顯示LPS/D-gal注射后2h小鼠血清sTNF-a達(dá)峰值，隨著時(shí)間延長(zhǎng)而降低，4h后幾乎消失；從

4、LPS/D-gal處理2h小鼠分離的KCs培養(yǎng)上清sTNF-a含量最高，而4h與6h分離的KCs培養(yǎng)上清sTNF-a雖然明顯降低，但仍然顯著高于正常鼠分離的KCs培養(yǎng)上清，提示循環(huán)中sTNF-a不能代表炎癥局部sTNF-a的變化。
　　2. tmTNF-a表達(dá)變化:用FCM分析急性肝衰小鼠KCs和PMs細(xì)胞表面tmTNF-a表達(dá)的變化，結(jié)果顯示在LPS/D-gal處理后2h及4h tmTNF-a呈低表達(dá)，而在6h tmTNF-a表

5、達(dá)顯著上升。
　　3.兩型TNF-a與血清轉(zhuǎn)氨酶關(guān)系：急性肝衰小鼠血清TNF-a變化與血清轉(zhuǎn)氨酶AST及ALT變化相反，而KCs和PMs表達(dá)tmTNF-a水平與肝組織是否放至血清ALT或AST的量呈正相關(guān)，提示是tmTNF-a而不是sTNF-a與急性肝組織損傷相關(guān)。
　　三、KCs-6h與PMs-6h分泌促炎和抑炎因子失衡
　　1.血清促炎因子IL-6與抑炎因子IL-10的比值變化：用 ELISA證實(shí)急性肝衰小鼠血清I

6、L-6顯著升高，其在4h達(dá)高峰，在6h則有所降低，為高峰水平的87.8％;而血清IL-10含量則在2h最高，隨后下降，其在6h的水平僅為高峰水平的23.6％。計(jì)算IL-6與IL-10比值，發(fā)現(xiàn)其在6h才顯著增加，與肝組織損傷變化一致，提示血清IL-6/IL-10比值增加可更好的預(yù)測(cè)急性肝損傷。
　　2.髙表達(dá)tmTNF-a的KCs-6h和PMs-6h分泌促炎和抑炎因子失衡:將LPS/D-gal注射后不同時(shí)間分離的KCs和 PMs在

7、體外進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果顯示這兩種巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-6與IL-10的變化與血清變化一致；IL-6/IL-10比值在急性肝衰6h顯著增加，與此時(shí)間點(diǎn)這2種巨噬細(xì)胞高表達(dá)tmTNF-a呈正相關(guān)；提示在LPS/D-gal處理6h分離的KCs(KCs-6h)和PMs(PMs-6h)分泌促炎和抑炎因子嚴(yán)重失衡，進(jìn)而加重肝臟的炎性損傷。
　　四、髙表達(dá)tmTNF-a的KCs-6h誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡
　　1. KCs-6h通過(guò)直接接觸誘導(dǎo)肝細(xì)胞

8、凋亡：將肝細(xì)胞與來(lái)自L(fǎng)PS/D-gal處理2h或6h的KCs進(jìn)行共培養(yǎng)，結(jié)果顯示，高表達(dá)tmTNF-a的KCs-6h細(xì)胞可通過(guò)直接接觸誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡增加，導(dǎo)致培養(yǎng)上清AST升高；而低表達(dá)tmTNF-a的KCs-2h細(xì)胞則無(wú)此效應(yīng)；當(dāng)用Transwell膜將KCs-6h細(xì)胞與肝細(xì)胞隔離培養(yǎng)后，無(wú)肝細(xì)胞出現(xiàn)凋亡。
　　2. KCs-6h細(xì)胞通過(guò)tmTNF-a直接誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡：當(dāng)用TNF-a抗體預(yù)處理KCs-6h細(xì)胞30min，以中和

9、其表達(dá)的tmTNF-a，再與肝細(xì)胞共培養(yǎng)，肝細(xì)胞凋亡顯著降低，提示KCs-6h細(xì)胞表達(dá)的tmTNF-a可直接誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡。
　　3.高表達(dá)tmTNF-a的KCs-6h細(xì)胞表達(dá)FasL增加：盡管用抗體中和tmTNF-a可顯著降低肝細(xì)胞凋亡，但仍有部分凋亡細(xì)胞，提示其它凋亡途徑可能參與了KCs-6h誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡。Real time PCR和 Western blotting的結(jié)果顯示高表達(dá)tmTNF-a的KCs-6h細(xì)胞表達(dá)Fas

10、L基因及其蛋白明顯高于低表達(dá)tmTNF-a的KCs-2h細(xì)胞，提示tmTNF-a可能通過(guò)增加FasL表達(dá)而促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡。
　　五、過(guò)繼KCs-6h細(xì)胞可加重LPS/D-gal誘導(dǎo)小鼠肝組織損傷
　　1. KCs-6h細(xì)胞可持續(xù)表達(dá)tmTNF-a:為了保證過(guò)繼有效性，首先檢查KCs-6h細(xì)胞tmTNF-a表達(dá)是否穩(wěn)定。結(jié)果顯示：連續(xù)培養(yǎng)KCs-6h細(xì)胞至6天，其表達(dá)tmTNF-a仍能維持原有水平；
　　2.過(guò)繼KCs-

11、6h細(xì)胞加重肝組織損傷：HE結(jié)果顯示：與LPS/D-gal組相比，過(guò)繼KCs-6h細(xì)胞可明顯加重小鼠在LPS/D-gal處理4h的肝組織損傷，表現(xiàn)為肝竇淤血，肝細(xì)胞索斷裂，水樣變性及少量壞死。
　　3.過(guò)繼KCs-6h促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡：肝組織切片TUNEL染色顯示，過(guò)繼KCs-6h細(xì)胞明顯促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡，血清AST也顯著高于過(guò)繼KCs-2h的小鼠，提示高表達(dá)tm TNF-a的KCs-6h在體內(nèi)可以加重LPS/D-gal誘導(dǎo)的肝衰。<

12、br>　　4.過(guò)繼KCs-6h增加血清IL-6/IL-10比值：ELISA結(jié)果顯示過(guò)繼KCs-6h細(xì)胞導(dǎo)致血清促炎因子IL-6和IL-1P含量明顯高于過(guò)繼KCs-2h組小鼠，而抑炎因子IL-10低于KCs-2h組小鼠，IL-6/IL-10比值明顯增力口，提示高表達(dá)tmTNF-a的KCs-6h分泌促炎和抑炎因子平衡障礙，從而參與急性肝衰的發(fā)生發(fā)展。
　　第二部分 跨模型TNF-a對(duì)內(nèi)毒素性休克的影響
　　一、特異性tmTNFA

13、b的制備與鑒定：
　　1. tmTNFAb的制備與鑒定:針對(duì)tmTNF-a單表位成功制備了兔抗小鼠tmTNF-a抗體。ELISA顯示兔血清含有高效價(jià)抗tmTNF-a單表位抗體，且只結(jié)合tmTNF-a肽段，不與sTNF-a發(fā)生交叉反應(yīng)。
　　2. tmTNFAb可與細(xì)胞表面 tmTNF-a結(jié)合：用FCM證實(shí)該抗體可與TNF-a+NH3T3細(xì)胞表面tmTNF-a結(jié)合，而不能與TNF-a陰性的CT26與H22細(xì)胞株結(jié)合，提示該抗體

14、可識(shí)別細(xì)胞表面完整的tmTNF-a分子。
　　二、tmTNFAb可有效阻斷tmTNF-a轉(zhuǎn)換為sTNF-a:
　　1. tmTNF Ab阻斷tmTNF-a轉(zhuǎn)換為sTNF-a:用100ng/mlLPS和tmTNFAb分別刺激RAW264.7巨噬細(xì)胞系和PMs原代細(xì)胞4h，ELISA和FCM結(jié)果顯示該抗體可有效抑制sTNF-a分泌，而顯著增加tmTNF-a的表達(dá)，提示該抗體可有效阻斷tmTNF-a轉(zhuǎn)換為sTNF-a。
　　

15、2. tmTNFAb抑制LPS誘導(dǎo)RAW264.7上清sTNF-a胞毒效應(yīng)：用生物活性證實(shí)LPS刺激RAW264.74h的上清對(duì)TNF-a敏感靶細(xì)胞L929具有明顯胞毒效應(yīng)，用TNF-a抗體預(yù)先中和上清sTNF-a后，可阻斷其胞毒效應(yīng);用tmTNFAb明顯抑制LPS刺激RAW264.7上清的胞毒效應(yīng)，再次證實(shí)tmTNFAb抑制tmTNF-a酶解，致使sTNF-a分泌減少，因而其胞毒效應(yīng)受到抑制。
　　四、tmTNFAb對(duì)LPS誘導(dǎo)

16、巨噬細(xì)胞產(chǎn)生促炎和抑炎因子的影響
　　1. tmTNFAb抑制LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO:用LPS和tmTNFAb刺激RAW264.7和PMs，結(jié)果顯示該抗體可明顯抑制LPS誘導(dǎo)這2種巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)錄iNOS基因以及分泌NO。
　　2. tmTNFAb抑制LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生促炎因子IL-6和IL-1P:用 LPS和tmTNFAb刺激RAW264.7和PMs，結(jié)果顯示該抗體可明顯抑制LPS誘導(dǎo)這2種巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)錄IL-6和IL-

17、1P基因及分泌這些細(xì)胞因子。
　　3. tmTNFAb對(duì)LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生抑炎因子IL-10無(wú)影響:用LPS和tmTNFAb刺激RAW264.7和 PMs，結(jié)果顯示該抗體對(duì)LPS誘導(dǎo)這2種巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)錄IL-10基因及其表達(dá)無(wú)影響。
　　五、tmTNFAb保護(hù)小鼠抵抗內(nèi)毒素血癥
　　1. tmTNFAb可阻斷內(nèi)毒素血癥小鼠tmTNF-a轉(zhuǎn)變?yōu)閟TNF-a：預(yù)先給予tmTNF-aAb明顯增強(qiáng)LPS注射小鼠4h腹腔巨噬細(xì)

18、胞的tmTNF-a表達(dá)，同時(shí)抑制該時(shí)間點(diǎn)內(nèi)毒素血癥小鼠血清TNF-a含量（P<0.01)，提示tmTNFAb在體內(nèi)可有效阻斷tmTNF-a轉(zhuǎn)換成sTNF-a。
　　2. tmTNF Ab可改善內(nèi)毒素性休克臨床癥狀，提髙小鼠存活率：用tmTNFAb可明顯減輕內(nèi)毒素性休克鼠唇紫紺，改善臨床評(píng)分，顯著提高內(nèi)毒素血癥小鼠的存活率。
　　3.tmTNFAb抑制內(nèi)毒素血癥促炎因子分泌:LPS注射小鼠2h血清促炎因子IL-6、IL-1P及

19、NO以及抑炎因子IL-10即開(kāi)始升高，6h達(dá)高峰，此后下降。用tmTNF Ab可明顯降低內(nèi)毒素血癥小鼠上述血清促炎因子的水平，卻輕度增加IL-10含量，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　綜上所述，tmTNF-a在不同的病理狀態(tài)下發(fā)揮不同的、甚至相反的作用。在LPS/D-gal誘導(dǎo)的急性鼠肝衰中KCs和PMs表達(dá)的tmTNF-a可直接誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡以及通過(guò)分泌促炎/抗炎因子失衡加重肝臟的炎性損傷。反之，用tmTNFAb促進(jìn)tmTNF-a表達(dá)，抑