益氣養(yǎng)陰活血法對糖尿病大鼠不同時期腎臟組織bax和bcl-2表達的影響.pdf

1、目的：糖尿病腎病( Diabetic nephropathy, DN)是糖尿病常見的嚴(yán)重微血管并發(fā)癥之一，也是導(dǎo)致終末期腎病及糖尿病患者死亡的主要原因，因此，有效防治DN的發(fā)生和發(fā)展具有重要意義。本研究通過腹腔注射STZ法建立糖尿病大鼠模型，之后應(yīng)用益氣養(yǎng)陰活血(Tonify-qi andnourish-yin, promote blood circulation, TNPC)法對該模型進行干預(yù)，通過觀察血糖(Glucose,GLU)，

2、總膽固醇(Total cholesterol,TC)，甘油三脂(Triglyceride,TG),24小時尿白蛋白排泄率(Urinary albumin excretionrate,UAER)，血尿素氮（BUN）、肌酐清除率(Ccr)，腎臟病理形態(tài)學(xué)變化以及腎組織中bax與bcl-2的水平，研究該法對DN的防治作用及其可能機制，為其臨床應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)與理論依據(jù)。
　　 方法：選用清潔級健康雄性Wistar大鼠50只，體重200

3、g±10g，普通飼料適應(yīng)喂養(yǎng)一周，檢測尿糖和尿蛋白均為陰性，空腹12小時后，隨機取38只造模，將新制成的1％的鏈脲佐菌素(Streptozotocin, STZ)溶液，按55mg/kg腹腔注射，剩余的12只為正常對照組(The Normal ControlGroup,NCG)，注射同量的0.1mmol/L枸櫞酸緩沖液。72小時后，分三日分別測38只模型大鼠隨機血糖三次，當(dāng)其中有兩次血糖≥16.7mmol/L時，確認糖尿病大鼠造模型成功，

4、隨機分為糖尿病模型組(Model Group，MG)，厄貝沙坦治療組(Irbesartan Group，IBG)，中藥治療組(Chinese MedicineTreatment Group,CMG)，各12只。各治療組(Treatment Group)在造模成功一周后開始按成人劑量的10倍給藥，每日一次。中藥組給予益氣養(yǎng)陰活血方，按32g/(kg·d)灌胃，厄貝沙坦組給予厄貝沙坦片按25mg/(kg·d)灌胃，正常組和模型組均以相應(yīng)量的

5、生理鹽水灌胃。給藥8周(8 weeks，8w)后從四組中各隨機取6只處死，其余6只12周(12 weeks,12w)后處死。處死前一天將大鼠置于代謝籠，收集24小時尿液，記尿總量，并測尿白蛋白排泄率，尿肌酐。12小時禁食水，稱體重（Body Weight,BW），斷尾測血糖，以2％戊巴比妥腹腔注射麻醉大鼠，經(jīng)股動脈取血，分別測總膽固醇、甘油三脂、血尿素氮(BUN)、肌酐清除率(Ccr)。處死動物，取出右側(cè)腎臟，去掉被膜，濾紙吸干血跡后稱

6、重，記錄腎重（Kidney Weight，KW）并計算肥大指數(shù)（腎重/體重，KW/BW）；取部分腎組織于4％多聚甲醛中固定，用于常規(guī)病理觀察及免疫組織化學(xué)檢測bax、bcl-2的表達，并用病理圖像分析軟件進行半定量分析。
　　 結(jié)果：
　　 1實驗大鼠的一般狀況
　　 正常組大鼠飲食正常，精神狀態(tài)好，反應(yīng)敏捷，尿量正常，體重明顯增加。其余三組注射STZ后，均出現(xiàn)明顯的多飲、多食、多尿癥狀，并慢慢出現(xiàn)精神萎靡、反應(yīng)

7、遲鈍、少動、皮毛無光澤、體型瘦小。12周時上述表現(xiàn)較8周時明顯，其中以模型組最為顯著。在注射STZ后3～5天，造模組有2只大鼠死亡，死亡原因可能為高血糖引起代謝紊亂，最終導(dǎo)致臟器衰竭。
　　 2各組大鼠24小時尿白蛋白排泄率
　　 8周和12周時，糖尿病組大鼠24小時尿白蛋白排泄率，較同期對照組比較均有明顯升高，有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.01、p＜0.05)。厄貝沙坦組、中藥組比模型組低，有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。厄貝沙

8、坦組與中藥組之間，無統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05)。糖尿病組12周與8周比較，變化不明顯，無統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05)。
　　 3各組血糖、總膽固醇、甘油三脂
　　 8周和12周時糖尿病組大鼠血糖、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)較同期對照組大鼠明顯增加，均有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。厄貝沙坦組、中藥組與模型組相比有差異(p＜0.05)，厄貝沙坦組與中藥組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05)。12周與8周比較，各治療組血糖、

9、TC和TG均有所降低，無統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05)。
　　 4各組大鼠腎功能（BUN、肌酐清除率）
　　 8周和12周時，糖尿病組大鼠血尿素氮升高和肌酐清除率的降低，較同期對照組均有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.01)。在厄貝沙坦組與中藥組，血尿素氮比模型組低，肌酐清除率比模型組高，均有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.01)。厄貝沙坦組與中藥組比較無差別(p＞0.05)。12周與8周比較，各治療組血尿素氮降低，肌酐清除率增加，無統(tǒng)計學(xué)意義(p

10、＞0.05)。
　　 5各組大鼠體重、右腎重、肥大指數(shù)( KW/BW)
　　 8周和12周時，糖尿病組大鼠體重下降、右腎重和肥大指數(shù)增加，較同期對照組有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。厄貝沙坦組和中藥組較模型組變化明顯，有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。厄貝沙坦組和中藥組之間，無差別(p＞0.05)。12周與8周比較，模型組、厄貝沙坦組和中藥組，體重、右腎重變化有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)；肥大指數(shù)變化，均無意義(p＞0.05)

11、。
　　 6腎臟病理形態(tài)光鏡觀察
　　 常規(guī)病理學(xué)觀察：光鏡下觀察，HE和Masson染色，糖尿病組大鼠較對照組腎小球體積增大，系膜基質(zhì)增多，系膜細胞輕度增生，部分腎小管上皮細胞發(fā)生空泡變性。12周時，還可見部分腎小管萎縮，部分?jǐn)U張，透明管型形成，腎小球及腎小管基底膜增厚，基質(zhì)增寬，纖維組織增生，球囊粘連。
　　 7免疫組織化學(xué)檢測bax、bcl-2表達
　　 7.1光鏡下觀察
　　 Bax在腎組

12、織中的表達：正常對照組表達于腎小球的足細胞、近曲小管、遠曲小管、集合管等上皮細胞胞漿中；糖尿病組，在足細胞增加，遠曲小管及小管間質(zhì)細胞明顯增加，8周時治療組較模型組在近曲小管及遠曲小管的表達減少，12周時在遠曲小管各段明顯減少。
　　 Bcl-2在對照組主要表達于近曲小管各段和皮髓交界處，遠曲小管和集合管有少許表達；糖尿病組，在部分近曲小管明顯減少，而部分近曲小管的表達未見明顯變化。8周時治療組較模型組，在近曲小管近段略有增加，

13、在遠端小管明顯增加；12周時在近曲小管表達呈明顯強陽性，皮髓交界處表達較高。
　　 7.2病理圖象半定量分析：
　　 8周和12周時，與正常對照組比較，bax的表達在模型組(P＜0.01)、厄貝沙坦組(P＜0.05)、中藥組(P＜0.05)腎組織內(nèi)的水平均明顯增加；厄貝沙坦組與中藥組明顯低于模型組(P＜0.01)；中藥組和厄貝沙坦組之間無明顯差別(P＞0.05)。12周與8周比較，模型組增加(P＜0.05)，中藥組、厄貝

14、沙坦組減少(P＜0.01)，正常組無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 8周和12周時bcl-2的表達在模型組、厄貝沙坦組、中藥組表達均明顯增加(P＜0.05)；厄貝沙坦組與中藥組高于模型組(P＜0.01)，中藥組和厄貝沙坦組之間無明顯差別(P＞0.05)。12周與8周比較，模型組減少(P＜0.01)、中藥組和厄貝沙坦組增加(P＜0.05)，正常組變化無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 8周和12周時，Bax/Bcl-

15、2，在模型組、中藥組和厄貝沙坦組較正常組高，均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。中藥組、厄貝沙坦組較模型組低(P＜0.05)，中藥組與厄貝沙坦之間無差別(P＞0.05)。12周與8周比較，Bax/Bcl-2在正常組(P＞0.05)、模型組(P＞0.05)無差別。中藥組和厄貝沙坦組的降低，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 1益氣養(yǎng)陰活血中藥可以降低糖尿病腎病大鼠的血糖，總膽固醇，甘油三酯。
　　 2益

16、氣養(yǎng)陰活血中藥可以減少糖尿病腎病大鼠的尿蛋白，降低血尿素氮，提高肌酐清除率，保護腎功能。
　　 3益氣養(yǎng)陰活血中藥可以有效抑制糖尿病腎病大鼠的腎小球毛細血管基底膜的增厚、系膜基質(zhì)的增生，延緩腎臟病理的進展。
　　 4益氣養(yǎng)陰活血中藥可以有效地上調(diào)bcl-2表達，降低bax表達，從而降低bax/bcl-2，減少腎組織的細胞凋亡，從而保護腎臟結(jié)構(gòu)的完整和功能的穩(wěn)定，且隨著療程的增加，這一作用趨勢可能更加顯著，為防治糖尿病腎病