控制性超排卵中過早黃素化對(duì)體外受精影響妊娠結(jié)局及分子機(jī)制的初步研究.pdf

1、控制性超排卵是目前臨床體外受精-胚胎移植治療程序中常規(guī)進(jìn)行的程序。隨著輔助生殖技術(shù)的快速發(fā)展，促排藥物的不斷改進(jìn)以及COH方案和監(jiān)測(cè)手段的不斷完善，胚胎移植后的著床率及臨床妊娠率都得以不斷提高，然而仍有超過半數(shù)的治療周期未能妊娠，其影響妊娠成功的因素和機(jī)制紛繁而復(fù)雜。其中在控制性超排卵中，注射人絨毛膜促性腺激素日常常發(fā)生過早的孕酮水平升高，同時(shí)在黃體生成素的作用下伴隨卵巢顆粒細(xì)胞過早向黃體細(xì)胞分化的過程，常稱為過早黃素化。關(guān)于過早黃素化

2、產(chǎn)生原因，在GnRH激動(dòng)劑或拮抗劑的運(yùn)用以前，一直認(rèn)為是黃體生成素所致，但是GnRH-a在臨床的運(yùn)用已經(jīng)能有效的抑制LH，但過早黃素化的發(fā)生率仍然高達(dá)13％至61％。研究表明過早黃素化對(duì)IVF-ET治療的影響主要是損害卵子和胚胎質(zhì)量，誘導(dǎo)卵母細(xì)胞過早恢復(fù)減數(shù)分裂，使子宮內(nèi)膜過早向分泌期轉(zhuǎn)化，影響子宮內(nèi)膜容受性，從而降低臨床妊娠率，但是也有研究認(rèn)為過早黃素化對(duì)臨床結(jié)局無影響。關(guān)于過早黃素化的分子機(jī)理國(guó)外有少量研究認(rèn)為可能與生長(zhǎng)分化因子9以

3、及神經(jīng)生長(zhǎng)因子表達(dá)異常有關(guān)，鑒于目前國(guó)內(nèi)外對(duì)過早黃素化與IVF-ET臨床結(jié)局的關(guān)系的研究仍然存在爭(zhēng)議以及我們對(duì)控制性超排卵中發(fā)生過早黃素化的分子機(jī)制遠(yuǎn)未了解，本研究采用回顧性統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析了HCG注射日過早黃素化與IVF結(jié)局的關(guān)系，并利用抑制消減雜交技術(shù)、macroarray分離和鑒定了過早黃素化顆粒細(xì)胞差異表達(dá)基因，并用real-time PCR、Western blot、流式細(xì)胞儀等技術(shù)檢測(cè)了過早黃素化顆粒細(xì)胞特異基因mRNA和蛋白

4、水平的表達(dá)差異，并分析了過早黃素化與顆粒細(xì)胞凋亡發(fā)生之間的關(guān)系，以期對(duì)研究過早黃素化的發(fā)生機(jī)制、預(yù)防、治療對(duì)策以及遠(yuǎn)期指導(dǎo)臨床超排卵合理用藥提供科學(xué)依據(jù)?！　〉谝徽驴刂菩猿怕阎羞^早黃素化對(duì)IVF結(jié)局的影響　　[目的]鑒于目前國(guó)內(nèi)外對(duì)過早黃素化與IVF-ET臨床結(jié)局的關(guān)系的研究仍然存在爭(zhēng)議探討長(zhǎng)方案體外受精-胚胎移植(IVF-ET)控制性超排卵中注射HCG日過早黃素化現(xiàn)象與IVF-ET妊娠率的關(guān)系，分析過早黃素化病因?！　方法]

5、回顧性分析2278個(gè)長(zhǎng)方案進(jìn)行IVF-ET的治療周期，采用ROC曲線篩選過早黃素化診斷閾值并根據(jù)該閾值進(jìn)行分組，從各組隨機(jī)抽取316個(gè)周期比較臨床參數(shù)。線性回歸分析hCG日孕激素與其他臨床變量之間的關(guān)系?！　結(jié)果]隨著過早黃素化程度加深(注射hCG日孕激素值升高)，臨床妊娠率呈明顯的下降趨勢(shì)；P>1.1 ng/mL是過早黃素化的最佳診斷閾值，具有94. 6％的敏感度，45.6％的特異度；有19.6％ (446)的治療周期發(fā)現(xiàn)過早黃素化

6、，過早黃素化組的FSH總用量，注射HCG日血清E2和LH水平以及回收卵數(shù)明顯高于非過早黃素化組周期，但是受精率，IVF優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)及IVF-ET妊娠率顯著低于非過早黃素化組。線性回歸分析僅鑒定出孕激素升高與E2水平和回收卵數(shù)相關(guān)。過早黃素化組的總臨床妊娠率明顯低于非過早黃素化組(38.6％ vs 48.1％)，兩組間移植胚胎數(shù)，ICSI優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)和ICSI妊娠率無明顯差異。 [結(jié)論]首次采ROC曲線篩選診斷過早黃素化診斷閾值。中國(guó)

7、女性診斷過早黃素化的最好的診斷標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)該是P>1. 1ng/ml，過早黃素化的出現(xiàn)可能與HCG日雌激素和回收卵子數(shù)有關(guān)，IVF-ET周期中過早黃素化可能導(dǎo)致卵子質(zhì)量下降，最終導(dǎo)致臨床妊娠率顯著下降；然而在ICSI周期中過早黃素化對(duì)優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)和妊娠率似乎并無顯著影響，在臨床中患者如若出現(xiàn)過早黃素化跡象，可適時(shí)建議進(jìn)行ICSI治療，以避開IVF-ET周期中PL對(duì)卵子的負(fù)面影響。 第二章控制性超排卵中過早黃素化顆粒細(xì)胞差異表達(dá)基因的分離

8、和鑒定 [目的]在COH中常常發(fā)生過早的孕激素升高，同時(shí)伴發(fā)過早卵巢顆粒細(xì)胞向黃體細(xì)胞分化的過程，稱為過早黃素化。其分子機(jī)理尚不清楚，為探索其分子基礎(chǔ)，應(yīng)用抑制消減雜交技術(shù)(SSH)構(gòu)建過早黃素化cDNA消減文庫，并采用macroarray(膜陣列)和RT-PCR鑒定相關(guān)的差異表達(dá)基因，了解這些差異基因與過早黃素化發(fā)生的關(guān)系。 [方法]分離入選的過早黃素化病人(PL組30例)和對(duì)照組病人(非PL組30例)的卵泡液顆粒細(xì)胞

9、。抽提顆粒細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，cDNA經(jīng)RsaI酶切后，將PL組cDNA分成兩組，分別與兩種不同的接頭街接，再與對(duì)照組cDNA進(jìn)行兩次消減雜交及兩次抑制巢式PCR反應(yīng)，將產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，構(gòu)建cDNA消減文序，并轉(zhuǎn)染大腸桿菌進(jìn)行文庫擴(kuò)增，隨機(jī)挑選陽性克隆經(jīng)PCR擴(kuò)增后進(jìn)行macroarray(膜陣列)雜交驗(yàn)證并RT-PCR半定量分析。經(jīng)驗(yàn)證的克隆送測(cè)序并進(jìn)行生物信息學(xué)同源性分析。 [結(jié)果]179個(gè)陽性克

10、隆被隨機(jī)挑選出來，86個(gè)克隆送測(cè)序并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。其中84個(gè)克隆代表了47個(gè)已知基因。這些基因參與類固醇合成，蛋白翻譯，細(xì)胞黏附，細(xì)胞代謝，脂質(zhì)代謝以及細(xì)胞凋亡。 [結(jié)論]首次成功構(gòu)建了COH中過早黃素化顆粒細(xì)胞的差異基因的cDNA消減文庫。這些基因功能涉及類固醇合成，蛋白翻譯，細(xì)胞黏附，細(xì)胞代謝，脂質(zhì)代謝以及凋亡。過早黃素化的發(fā)生可能與顆粒細(xì)胞內(nèi)過度活躍的類固醇合成，脂質(zhì)合成，凋亡活動(dòng)以及細(xì)胞因子表達(dá)異常有關(guān)，研究這些差

11、異基因與過早黃素化發(fā)生之間的關(guān)系，將有助于我們進(jìn)一步了解過早黃素化發(fā)生的分子機(jī)制。 第三章過早黃素化差異基因mRNA及蛋白分析　　 [目的]進(jìn)一步研究這些差異基因及編碼蛋白在過早黃素化發(fā)生進(jìn)程中的差異表達(dá)情況以及作用機(jī)制，我們根據(jù)第二章的研究結(jié)果、差異基因與過早黃素化發(fā)生的相關(guān)性以及我們所能獲得的研究材料，挑選出部分基因采用real-time PCR和Western blot進(jìn)行mRNA水平和蛋白水平的研究。 [

12、方法]分離入院行輔助生殖技術(shù)治療時(shí)發(fā)生過早黃素化病人和未發(fā)生過早黃素化病人的卵泡液顆粒細(xì)胞，一部分顆粒細(xì)胞提取RNA和細(xì)胞總蛋白，RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用real-time PCR分析兩組間類固醇急性合成調(diào)節(jié)蛋白、乙酰輔酶A羧化酶、P450側(cè)鏈裂解酶、PHLDA1以及ubiquitin protein ligase E3的mRNA表達(dá)差異，細(xì)胞總蛋白采用Western blot方法分析兩組間StAR、GDF9、bcl-2、PHLD

13、A1蛋白表達(dá)差異。另一部分顆粒細(xì)胞分離后培養(yǎng)一部分添加GDF9 (200ng/ml)干預(yù)，繼續(xù)48小時(shí)培養(yǎng)觀察GDF9對(duì)StAR蛋白的表達(dá)的影響。 [結(jié)果]在過早黃素化顆粒細(xì)胞中StAR、ACC、P450scc、PHLDA1及ubiquitin protein ligase E3的mRNA表達(dá)水平顯著升高，而bcl-2和GDF9的mRNA表達(dá)下降(P<0.05)。蛋白水平上發(fā)現(xiàn)StAR(30kDa)、PHLDA1(40kDa)、

14、bcl-2 (26kDa)、GDF9(51kDa)蛋白均能在顆粒細(xì)胞中表達(dá)，過早黃素化顆粒細(xì)胞中StAR (30kD)和PHLDA1(40kD)蛋白表達(dá)明顯上調(diào)。然而bcl-2(26kDa)和GDF9(51kD)蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)。培養(yǎng)的顆粒細(xì)胞添加GDF9 (200ng/ml)干預(yù)后，顆粒細(xì)胞StAR蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，但基礎(chǔ)StAR活性并未受到影響。 [結(jié)論]GDF9能明顯抑制顆粒細(xì)胞內(nèi)過度活躍的類固醇合成活性，但并不影響基

15、礎(chǔ)類固醇合成活性。過早黃素化的發(fā)生可能與GDF9過低表達(dá)以及凋亡基因PHLDA1表達(dá)升高和抗凋亡基因bcl-2表達(dá)過低導(dǎo)致的顆粒細(xì)胞凋亡活動(dòng)增加有關(guān)。 第四章IVF-ET中顆粒細(xì)胞凋亡與過早黃素化關(guān)系 [目的]細(xì)胞凋亡是指在特定信號(hào)誘導(dǎo)下，一系列基因按程序時(shí)空順序表達(dá)，細(xì)胞內(nèi)死亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致程序性細(xì)胞死亡。生殖系統(tǒng)內(nèi)組織細(xì)胞的凋亡變化在妊娠過程中有重要意義，任何一個(gè)環(huán)節(jié)失調(diào)，都可能影響妊娠的順利進(jìn)行。卵泡凋亡最初是從顆粒

16、細(xì)胞開始發(fā)生的。在前面研究中我們?cè)谶^早黃素化顆粒細(xì)胞中篩選出兩個(gè)與凋亡相關(guān)的基因PHLDA1和bcl-2并發(fā)現(xiàn)PHLDA1表達(dá)水平上調(diào)，而抗凋亡基因bcl-2表達(dá)下降，同時(shí)觀察到GDF9表達(dá)下降，因此我們推測(cè)細(xì)胞內(nèi)凋亡活動(dòng)上調(diào)也是過早黃素化發(fā)生的原因之一，而GDF9可能具有拮抗顆粒細(xì)胞凋亡的作用，本章的目的即為驗(yàn)證此假設(shè)。 [方法]根據(jù)細(xì)胞在凋亡啟動(dòng)時(shí)發(fā)生細(xì)胞皺縮，細(xì)胞膜發(fā)泡等形態(tài)異常，以及細(xì)胞膜發(fā)生磷脂酰絲氨酸外翻這一特點(diǎn)，采

17、用流式細(xì)胞儀和AnnexinⅤ/FITC和PI雙標(biāo)法檢測(cè)了過早黃素化顆粒細(xì)胞凋亡情況。此外，我們觀察了添加200ng/mlGDF9干預(yù)對(duì)顆粒細(xì)胞凋亡的影響。 [結(jié)果]與非過早黃素化顆粒細(xì)胞(P<1.1ng/ml)相比，過早黃素化顆粒細(xì)胞形態(tài)異常率升高(16.28％ vs 5.38％，P<0.05)；過早黃素化組顆粒細(xì)胞的平均凋亡率明顯增加(25.43％ vs 10.05％，P<0.05)；過早黃素化組(P=1.4ng/ml、1.