基于DNA條形碼的瀕危木材識別技術(shù)研究.pdf

1、隨著全球森林資源貿(mào)易量的急劇增加，木材尤其是熱帶木材物種已迅速成為《瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約》(CITES)近年來關(guān)注的焦點(diǎn)。開展木材識別技術(shù)研究，實(shí)現(xiàn)其科學(xué)與準(zhǔn)確識別，是保護(hù)瀕危木材資源的關(guān)鍵技術(shù)基礎(chǔ)。僅依靠傳統(tǒng)木材解剖技術(shù)，一般只能識別木材到“屬”或“類”，無法實(shí)現(xiàn)“種”的識別。最新發(fā)展的木材DNA條形碼識別技術(shù)為解決這一科學(xué)難題提供了可能。盡管植物DNA提取與分析技術(shù)已日趨成熟，但對于經(jīng)過干燥加工或長期存儲的木材，則很難獲得高

2、質(zhì)量的DNA。本論文針對干燥處理或長期存儲的木材組織，通過突破DNA高效提取技術(shù)瓶頸，并優(yōu)選確定DNA條形碼，以實(shí)現(xiàn)瀕危木材“種”的識別。
　　本研究通過優(yōu)化溫浴時間、木粉量與DNA裂解液體積比、裂解液化學(xué)成分等技術(shù)參數(shù)，改進(jìn)了木材DNA提取技術(shù);并定量比較改進(jìn)的CTAB法與改進(jìn)的Qiagen試劑盒法，優(yōu)選了木材DNA提取方案，初步建立了木材DNA提取技術(shù)體系。利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，對多條短DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增;通過BLAS

3、T序列比對及構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，優(yōu)選確定了適用于木材識別的DNA條形碼類型及片段長度，并分析了干燥處理及存儲時間等因素對木材DNA的影響。基于篩選確定的DNA條形碼，實(shí)現(xiàn)了瀕危木材“種”的科學(xué)準(zhǔn)確識別，推動了木材識別新技術(shù)的發(fā)展，同時也為我國提高CITES公約履約能力提供了關(guān)鍵技術(shù)支撐。
　　主要結(jié)果歸納如下:
　　(1)初步建立了以改進(jìn)的Qiagen試劑盒法為基礎(chǔ)的木材DNA提取技術(shù)體系。本研究以杉木(Cunninghamia

4、 lanceolata(Lamb.) Hook.）為實(shí)驗(yàn)對象，采用延長木粉溫浴時間、減小木粉量與DNA裂解液體積比、優(yōu)化裂解液的化學(xué)成分、多份DNA裂解液過同一DNA吸附柱等改進(jìn)措施，形成了優(yōu)化的木材DNA提取技術(shù)。同時，確定了改進(jìn)的Qiagen試劑盒DNA提取方法優(yōu)于改進(jìn)的CTAB法。研究結(jié)果為進(jìn)一步開展木材DNA識別工作提供了高效DNA提取技術(shù)基礎(chǔ)。
　　(2)確定了木材不同徑向位置對DNA提取的影響。從木材邊材到心材，DNA

5、含量呈減少趨勢;從木材邊材和心邊材過渡區(qū)提取的DNA純度通常高于心材DNA。
　　(3)針對80℃和120℃不同溫度干燥處理的白木香(Aquilaria sinensis(Lour.) Gilg）木材，采用改進(jìn)的Qiagen試劑盒法進(jìn)行木材DNA提取，分析了干燥處理對木材DNA的影響。經(jīng)過80℃干燥處理后的木材邊材及心材，長度為300-500 bp的葉綠體及細(xì)胞核核糖體DNA片段依然能PCR擴(kuò)增成功;但經(jīng)過120℃干燥處理后，木材

6、邊材葉綠體及細(xì)胞核核糖體DNA片段能成功擴(kuò)增，而心材DNA片段卻未擴(kuò)增成功。高溫加速DNA分子鏈酶解、水解及氧化反應(yīng)，導(dǎo)致DNA降解成小片段分子，需擴(kuò)增目的片段可能被降解。
　　(4)選取30年、57年、80年和3600年等不同存儲年限的胡楊(Populus euphraticaOliv.)木材，通過PCR擴(kuò)增一系列不同長度的DNA片段，評估了不同存儲時間木材DNA的保存狀況。對于存儲30年的木材標(biāo)本，長度為100-800 bp之

7、間的DNA片段均能PCR擴(kuò)增成功;存儲57年的木材標(biāo)本，僅長度200 bp左右或更短的葉綠體DNA片段成功擴(kuò)增;存儲80年的木材標(biāo)本，僅長度100 bp左右的葉綠體DNA片段成功擴(kuò)增;而對于存儲3600年的考古木材，即使長度約100 bp的葉綠體DNA片段也未擴(kuò)增成功。隨著存儲時間的延長，由于水解反應(yīng)、氧化反應(yīng)以及微生物分解作用，木材DNA逐漸降解成小片段分子。
　　(5)篩選確定了適用于木材識別的DNA條形碼類型及片段長度。針對

8、不同樹種及不同存儲狀況的木材，應(yīng)選擇適于鑒別物種的不同類型及長度的DNA條形碼。本研究中，能有效識別白木香木材的DNA條形碼為trnL-trnF和ITS1;DNA條形碼rbcL及ITS或者多個短DNA條形碼組合適用于鑒別胡楊木材;DNA條形碼trnL比matK和psbA-trn更適用于區(qū)分微凹黃檀（Dalbergia retusa Hemsl.）、危地馬拉黃檀（Dalbergia tucurensisDonn.Sm.）及交趾黃檀（Dal

9、bergia cochinchinensis Pierre）這3種黃檀屬木材的識別條形碼。此外，綜合木材DNA降解和DNA片段識別信息位點(diǎn)數(shù)等因素，建議選擇的DNA條形碼長度為200-500 bp。
　　(6)基于DNA條形碼技術(shù)可成功實(shí)現(xiàn)木材“種”的準(zhǔn)確識別。通過優(yōu)選的DNA條形碼構(gòu)建最大簡約樹或鄰接樹等系統(tǒng)進(jìn)化樹，能夠?qū)崿F(xiàn)瀕危樹種白木香木材，長期存儲胡楊木材，及微凹黃檀、危地馬拉黃檀和交趾黃檀等3種瀕危黃檀屬木材“種”的識別。