小鼠骨髓衍生肝干細(xì)胞的篩選及其分化潛能的研究.pdf

1、肝臟疾病的終末期治療，現(xiàn)在僅肝臟移植為唯一有效途徑，供肝的缺乏和大量免疫排斥，不僅為移植的選擇帶來了困難，而且降低了患者正常免疫和加重了經(jīng)濟(jì)上的負(fù)擔(dān)。肝細(xì)胞移植(hepatoyctetransplantationHTx)研究經(jīng)過30多年的努力，取得了不少進(jìn)展，但仍存在不少問題。HTx有望成為肝功能衰竭和先天性代謝性障礙的一種有效替代治療以及過渡至肝移植的橋梁治療手段，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。但臨床應(yīng)用中關(guān)于肝細(xì)胞來源缺乏，移植肝細(xì)胞數(shù)量

2、和移植部位的選擇，免疫排斥的防治等問題尚有待解決。雖然國內(nèi)外在移植后肝細(xì)胞增殖和避免免疫排斥上做了大量工作和努力，但現(xiàn)階段治療效果仍然欠佳，限制了臨床運(yùn)用。因此，尋找一種新的治療方法成為當(dāng)務(wù)之急。 干細(xì)胞不僅具有自我復(fù)制，還具有分化成其他一種或更多種不同細(xì)胞類型的能力?？梢愿鶕?jù)解剖結(jié)構(gòu)、功能、表面抗原、轉(zhuǎn)移因子、蛋白質(zhì)表達(dá)等不同，將它們進(jìn)行區(qū)分。目前干細(xì)胞家族比較明確的區(qū)分方式為：來源于胚胎組織的干細(xì)胞——胚胎干細(xì)胞；來源于成人

3、組織器官的干細(xì)胞——成體干細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞具有分化形成身體任何組織細(xì)胞的能力；成體干細(xì)胞具有一定的增殖能力，并保持分化的潛能。成體干細(xì)胞的進(jìn)一步分化則是成年動物體內(nèi)組織和器官修復(fù)再生的基礎(chǔ)。有關(guān)成體干細(xì)胞的一個重大發(fā)現(xiàn)是其具有“橫向分化”能力，比如骨髓干細(xì)胞可形成腦細(xì)胞和三種肌細(xì)胞一心肌、骨骼肌和平滑肌細(xì)胞以及肝細(xì)胞的前體。干細(xì)胞的“橫向分化”理論改寫了“組織特異性干細(xì)胞只能定向分化”的經(jīng)典理論，為利用成體干細(xì)胞治療疾病帶來新的希望。

4、 由于成體骨髓干細(xì)胞具有許多其他干細(xì)胞無法比擬的優(yōu)勢，目前在肝臟修復(fù)方面的研究文獻(xiàn)報(bào)道多采用成體骨髓干細(xì)胞。骨髓干細(xì)胞可簡單分為造血干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞。骨髓干細(xì)胞沒有明確的形態(tài)特征，都表現(xiàn)為淋巴細(xì)胞樣細(xì)胞的單個核母細(xì)胞，所含大量的標(biāo)志物則常被用來進(jìn)一步區(qū)分骨髓干細(xì)胞群。不同標(biāo)志物可代表骨髓干細(xì)胞發(fā)育的不同階段。在眾多的骨髓干細(xì)胞標(biāo)志物中，文獻(xiàn)中曾報(bào)道Thy1.1、CD34、Sca-1等骨髓細(xì)胞群可以分化形成肝細(xì)胞，人c-Kit細(xì)

5、胞群可以分化形成膽管細(xì)胞。但到底上述報(bào)道的特定標(biāo)記骨髓干細(xì)胞群中究竟哪種細(xì)胞群轉(zhuǎn)化為肝臟細(xì)胞效果最佳及潛力最大，仍需要實(shí)驗(yàn)進(jìn)行比較。文獻(xiàn)中常把具有分化形成肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞潛能的骨髓干細(xì)胞統(tǒng)稱為骨髓衍生肝干細(xì)胞。但該群細(xì)胞到底是一種獨(dú)立的細(xì)胞群，還是骨髓干細(xì)胞在不同背景與環(huán)境條件下的橫向分化潛能表現(xiàn)，目前還不清楚。從骨髓細(xì)胞群中分選出分化形成肝細(xì)胞潛能最大的細(xì)胞群，這將是最有研究價(jià)值和最有應(yīng)用價(jià)值的骨髓衍生肝干細(xì)胞群。 移植干細(xì)胞

6、的歸巢是影響移植療效的關(guān)鍵。在過去的相關(guān)報(bào)道中，發(fā)現(xiàn)當(dāng)組織損傷嚴(yán)重時(shí)，自身會釋放出不同的細(xì)胞因子誘導(dǎo)細(xì)胞趨化歸巢，關(guān)鍵還是看肝臟的損傷程度。我們將小鼠進(jìn)行全肝臟照射，破壞肝細(xì)胞和肝臟本身原始細(xì)胞。不僅抑制了肝原始細(xì)胞的再生，同時(shí)達(dá)到破壞肝細(xì)胞的目的。 本實(shí)驗(yàn)按不同細(xì)胞表面標(biāo)記將雄性小鼠骨髓干細(xì)胞分離，分別為Thy1.1+lin-，CD34+lin-，Sca-1+lin-，c-Kit+lin-。將上述不同表型細(xì)胞群按同一數(shù)量移植入

7、同種同品系雌性模型小鼠體內(nèi)，觀察移植細(xì)胞在肝臟形態(tài)、分布、分化狀況，并比較分化為肝細(xì)胞數(shù)目。為進(jìn)一步進(jìn)行骨髓衍生肝干細(xì)胞肝內(nèi)移植治療肝疾病的研究提供基礎(chǔ)。 [材料和方法] 1.小鼠骨髓干細(xì)胞分離和檢測 1.1免疫活性細(xì)胞磁珠分選法(MagneticactivatedcellseparationMACS)分離骨髓干細(xì)胞 取6～8周SPF級BALB/c雄系性小鼠，利用骨髓干細(xì)胞抗原表面標(biāo)記，采用MACS方法分

8、離Thyl.1+lin-，CD34+lin-，Sca-1+lin-，c-Kit+lin-細(xì)胞。 1.2流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞純度。 先用PE標(biāo)記細(xì)胞群，將分離前細(xì)胞群和分離后細(xì)胞群進(jìn)行比較，可檢測細(xì)胞標(biāo)記在分選前后的純度情況及一抗和抗體磁珠結(jié)合情況。 2.同種同品系肝內(nèi)移植不同細(xì)胞群 2.1移植前小鼠預(yù)處理 取6～8周齡的SPF級純系BALB/C雌性小鼠，質(zhì)量均為20g。150只雌性小鼠實(shí)施6MV高能

9、X射線直線加速器一次性全肝照射，劑量率為200cGy/min，總劑量為35Gy。 2.2肝內(nèi)移植 移植前，將分離好的供體雄性小鼠目的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，離心8℃條件，10min，×1500rmp。棄上清，加入Buffer22.5ml重懸細(xì)胞。調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度1×106個/ml，移植組每只予100μl細(xì)胞懸液尾靜脈注射。對照組僅予以注射Buffer2(PBS，PH7.2+0.5％BSA+2mMEDTA)100μl。 2.3各

10、組小鼠生存率情況比較 2.4細(xì)胞移植后，肝臟保護(hù)情況 于移植1月后活殺小鼠取血清，測量血清中ALT和Alb指標(biāo)。 2.5肝組織常規(guī)病理檢查 解剖小鼠完整取出肝臟組織，石蠟包埋，按標(biāo)準(zhǔn)操作染色，光鏡下觀察結(jié)果。 2.6原位雜交檢查 切片防脫RNA處理。設(shè)計(jì)制備并運(yùn)用Y染色體cDNA探針，按原位雜交方法操作，光鏡下觀察結(jié)果。 2.7免疫組化 按照說明書進(jìn)行操作，用ABC法進(jìn)行白

11、蛋白(AEC)復(fù)染。光鏡下觀察結(jié)果。 2.8原位雜交和免疫組化復(fù)染 方法同上，在同一切片上先行原位雜交，而后行免疫組化。觀察干細(xì)胞移植分化情況及功能表達(dá)。 2.9骨髓干細(xì)胞肝內(nèi)增殖情況比較 各組取6張片子計(jì)數(shù)，比較移植細(xì)胞肝內(nèi)轉(zhuǎn)化情況。 2.10統(tǒng)計(jì)分析 所有數(shù)據(jù)用-x±s表示。應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。生存情況運(yùn)用Kaplan-Meier法；余所有數(shù)據(jù)采用單向量方差

12、分析(One-wayANOVA)。P＜0.05。 [結(jié)果] 1.MACS分離每組細(xì)胞純度均達(dá)到84％，回收率達(dá)到80％以上。 2.移植一月后c-Kit+lin-細(xì)胞組生存率最高。且肝功能指標(biāo)最接近正常。 3.移植一月后，移植組內(nèi)均未發(fā)現(xiàn)移植干細(xì)胞組有肝纖維化，對照組肝臟纖維化較明顯。 4.原位雜交和免疫組化復(fù)染結(jié)果表明：各實(shí)驗(yàn)組均有移植細(xì)胞在肝內(nèi)定居并轉(zhuǎn)化成有功能的肝細(xì)胞。 5.每組肝細(xì)胞

13、中均發(fā)現(xiàn)移植細(xì)胞來源的肝細(xì)胞，但細(xì)胞數(shù)均小于c-Kit+lin-細(xì)胞組。c-Kit+lin-細(xì)胞轉(zhuǎn)化形成肝細(xì)胞的數(shù)量明顯高于其他細(xì)胞組。 [結(jié)論] 1.MACS細(xì)胞分選系統(tǒng)能有效分選不同骨髓干細(xì)胞，純度和回收率均較高。 2.小鼠骨髓干細(xì)胞Thyl.1+lin-，CD34+lin-，Sca-1+lin-，c-Kit+lin-細(xì)胞移植后，均有阻止放射性肝炎向肝纖維化演變的作用。 3.小鼠Thyl.1+lin-