紅景天促血管生長(zhǎng)作用與其組方的比較和機(jī)制的研究.pdf

1、本研究首先采用雞胚尿囊膜為研究模型，比較了紅景天及其組方的促血管生長(zhǎng)作用。然后以臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞為模型，研究紅景天對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞血管生長(zhǎng)相關(guān)基因的影響。最后制造大鼠急性心肌梗死模型，并用紅景天干預(yù)后，探討心肌梗死不同部位血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體VEGFR2、低氧誘導(dǎo)因子HIFla、E26轉(zhuǎn)化特定因子ETSl和生長(zhǎng)分化因子GDFl5以及ERKI／2磷酸化程度的改變。 第一部分紅景天及其組方促雞胚尿囊膜血管生長(zhǎng)作用的比較 目的：1比較

2、體外生藥紅景天及其組方五味方的促雞胚尿囊膜血管生長(zhǎng)作用； 2探討血清藥理學(xué)研究的適當(dāng)條件； 3比較紅景天含藥血清和五味方含藥血清的促雞胚尿囊膜血管生長(zhǎng)作用。 方法：以雞胚尿囊膜為研究模型，首先對(duì)紅景天、中藥A、中藥B、中藥C、中藥D，每種中藥有醇提和水提醇沉兩種制劑，以及有紅景天參與的五味方和無(wú)紅景天參與的四味方的促血管生長(zhǎng)作用進(jìn)行比較。然后以五味方為工具藥，并以具有確切促血管生長(zhǎng)作用的麝香保心丸為對(duì)照，以動(dòng)物喂

3、藥天數(shù)、喂藥劑量、采血時(shí)間為主要研究因素，每個(gè)因素設(shè)4個(gè)觀察水平，比較不同條件下得到的五味方含藥血清和麝香保心丸含藥血清促雞胚尿囊膜血管生長(zhǎng)作用的大小。優(yōu)選出適合研究五味方含藥血清促血管生長(zhǎng)作用的一套參數(shù)，并在相同條件下制備紅景天含藥血清并與五味方進(jìn)行比較。結(jié)果：1紅景天較其組方五味方促雞胚尿囊膜血管生長(zhǎng)作用更強(qiáng)。紅景天醇提制劑和水提醇沉制劑的促血管生長(zhǎng)作用無(wú)明顯差異。 2喂藥天數(shù)和喂藥劑量是血清藥理學(xué)研究重要的影響因素，以五味

4、方和麝香保心丸為研究藥物制備的血清在5倍臨床等效劑量喂藥動(dòng)物4天后采血，促雞胚尿囊膜血管生長(zhǎng)作用最強(qiáng)(P<0．05)。采血時(shí)間以末次喂藥后半小時(shí)采血得到的血清作用較強(qiáng)，但是與其它時(shí)間點(diǎn)比較后未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0．05)。血清是否滅活對(duì)其促血管生長(zhǎng)作用無(wú)影響(P>0．05)，五味方含藥血清的作用較麝香保心丸強(qiáng)(P<0．05)。 3比較5倍臨床等效劑量喂藥動(dòng)物4天后得到的紅景天血清和五味方血清，紅景天含藥血清較五味方含藥血清的促

5、雞胚尿囊膜血管生長(zhǎng)作用強(qiáng)(血管計(jì)數(shù)20．5±lvs16．5±O．55，P<0．05)。 結(jié)論：紅景天較其組方的促血管生長(zhǎng)作用強(qiáng)。 第二部分紅景天對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞血管生長(zhǎng)相關(guān)基因的影響 目的：觀察紅景天對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞哪些血管生長(zhǎng)相關(guān)基因有影響 方法：首先用MTT法選擇促臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的適當(dāng)?shù)募t景天藥液濃度。在此濃度下處理內(nèi)皮細(xì)胞24小時(shí)后收集細(xì)胞RNA，并以未用紅景天藥液培養(yǎng)的細(xì)胞作對(duì)照，進(jìn)行GEArray

6、QSeriesHumanAngiogenesisGeneArray檢測(cè)。對(duì)結(jié)果選取有意義的基因用實(shí)時(shí)定量PCR法進(jìn)行檢測(cè)。 結(jié)果：紅景天藥液在500ug／ml時(shí)促內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)作用明顯。在此濃度下處理的細(xì)胞與對(duì)照組進(jìn)行比較，在96個(gè)血管生長(zhǎng)相關(guān)基因中有50個(gè)基因上調(diào)>2倍。其中涉及VEGF及其受體家族、FGF及其受體家族、TGFb及其受體家族、細(xì)胞因子和趨化因子CSF、TNF，核轉(zhuǎn)錄因子SMADl、ETSl，細(xì)胞外基質(zhì)蛋白酶MMP

7、家族等多項(xiàng)與血管生長(zhǎng)相關(guān)的基因家族。對(duì)其中的VEGFR2、ETSl、G-CSF、TNFa、TGFbRl、TGFbR2和SMADl進(jìn)行驗(yàn)證的結(jié)果與芯片結(jié)果一致，均上調(diào)>2倍。 結(jié)論：紅景天對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞血管生長(zhǎng)相關(guān)基因的影響是多因素多環(huán)節(jié)的，構(gòu)成一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，其核心成員可能是VEGF、FGF和TGFb家族。 第三部分：紅景天對(duì)梗死后心肌血管再生期的影響 目的：比較大鼠急性心肌梗死后2周內(nèi)(梗死后1天、4天、7天和14

8、天)，心肌不同部位(梗死中央、梗死邊緣和梗死遠(yuǎn)處)HIFla、VEGFR2、ETSl和GDFl5表達(dá)以及ERKl／2磷酸化程度的動(dòng)態(tài)改變以及紅景天干預(yù)后的結(jié)果。比較它們與梗死局部微血管密度以及心功能的關(guān)系。 方法：結(jié)扎大鼠冠脈前降支進(jìn)行急性心肌梗死造模。造模后分成紅景天喂藥組(3g/kg/d≈2mD和生理鹽水喂養(yǎng)組(2ml／d)。另設(shè)假手術(shù)組和正常大鼠組。在造模后24小時(shí)內(nèi)開始喂藥。喂藥后1天、4天、7天和14天分批處死大鼠，每

9、批4只紅景天組，4只生理鹽水組、4只假手術(shù)組和1只正常組。4天、7天和14天大鼠處死前經(jīng)頸動(dòng)脈插管檢測(cè)LVP和dp／dt。大鼠處死后取出心臟，沿心臟長(zhǎng)軸位切開，一半放入10％福爾馬林保存，然后進(jìn)行CD34免疫組化染色。另一半分別在梗死中央、邊緣和遠(yuǎn)處取心肌組織即刻液氮保存。對(duì)上述組織用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)HIFla、VEGFR2、ETSl和GDFl5表達(dá)，Westernblot法檢測(cè)ERKl／2磷酸化程度。 結(jié)果：1)未用紅景天

10、干預(yù)的生理鹽水組和紅景天組大鼠梗死心肌局部微血管密度隨時(shí)間延長(zhǎng)增加。生理鹽水組從第7天開始微血管密度明顯增加并持續(xù)到14天。紅景天組從第4天開始微血管密度明顯增加，同樣持續(xù)到14天。從第4天開始到14天，紅景天組的微血管密度均大于生理鹽水組。假手術(shù)組在14內(nèi)微血管密度無(wú)動(dòng)態(tài)改變。2)紅景天對(duì)心肌表達(dá)HIFla和VEGFR2／KDR的影響基本一致。VEGFR2的表達(dá)在心梗后未用紅景天干預(yù)的情況下，從相同部位的時(shí)間變化上看，在梗死中央、梗死

11、邊緣和梗死遠(yuǎn)處都是第4天開始VEGFR2表達(dá)增加并持續(xù)到第14天。在梗死中央?yún)^(qū)域是14天達(dá)最高水平；在梗死邊緣和梗死遠(yuǎn)處是第4天時(shí)表達(dá)最高，以后略下降，但至M天時(shí)表達(dá)仍較1天時(shí)高。從相同時(shí)間的不同部位來(lái)看，第1天和第14天各部位表達(dá)無(wú)明顯差異。第4天和第7天表達(dá)從高到低均是梗死遠(yuǎn)處>梗死邊緣>梗死中央。在用紅景天干預(yù)的情況下，從相同部位的時(shí)間變化上來(lái)看，在梗死中央和梗死邊緣都是從第4天開始表達(dá)增加并持續(xù)到第14天。在梗死中央是第7天表達(dá)

12、最高，在梗死邊緣是第M天表達(dá)最高。在梗死遠(yuǎn)處是第7天表達(dá)最高，第4天和第14天較第1天無(wú)明顯差異。兩組比較可見紅景天對(duì)大鼠梗死心肌的影響主要在第7天和第14天。第7天時(shí)對(duì)各部位都有上調(diào)的作用，第M天時(shí)主要是梗死邊緣部位表達(dá)上調(diào)。3)在HIFla的表達(dá)上來(lái)看，在心梗后未用紅景天干預(yù)的情況下，各部位從第4天開始表達(dá)有增加趨勢(shì)且持續(xù)到第14天，但是均未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在相同時(shí)間內(nèi)比較不同部位的表達(dá)。第1天和第M天時(shí)梗死邊緣分別是梗死中央的3．

13、92倍和3．48倍。第4天和第7天各部位比較無(wú)明顯差異。在紅景天組，在各部位都是從第4天開始表達(dá)增加。在梗死中央和梗死邊緣都是第7天表達(dá)最高，分別是第1天的4．8倍和4．65倍。在梗死遠(yuǎn)處，從第4天開始有增高趨勢(shì)但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。比較相同時(shí)間內(nèi)不同部位的表達(dá)。在各時(shí)間點(diǎn)，均以梗死邊緣的表達(dá)較高，第1天、第4天、第7天和第14天梗死邊緣表達(dá)分別是梗死中央的1．34倍，1．41倍，1．3倍和2．5倍，但是均未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。兩組比較，紅景

14、天對(duì)梗死心肌的影響主要在梗死后第7天的梗死中央和梗死邊緣，分別是生理鹽水組的4．72倍和2．86倍。4)在ETSl的表達(dá)上，在心梗后未用紅景天干預(yù)的情況下，從相同部位的時(shí)間變化上來(lái)看，在梗死中央和梗死遠(yuǎn)處各時(shí)間點(diǎn)無(wú)明顯差異。在梗死邊緣從第4天開始表達(dá)增加且持續(xù)到第14天，在第14天表達(dá)最高。從相同時(shí)間的不同部位來(lái)看，第l天、第7天和第14天都是梗死遠(yuǎn)處表達(dá)最高，其次是梗死邊緣，梗死中央表達(dá)最低。第4天時(shí)梗死邊緣表達(dá)最高，其次是梗死遠(yuǎn)處，

15、梗死中央表達(dá)最低。在心梗后用紅景天干預(yù)后，從相同部位的時(shí)間變化上來(lái)看，在梗死中央和梗死邊緣都是從第4天開始表達(dá)增加且持續(xù)到第14天，都是在第7天時(shí)表達(dá)最高。在梗死遠(yuǎn)處各時(shí)間點(diǎn)無(wú)明顯差異。從相同時(shí)間的不同部位來(lái)看，情況同生理鹽水組。兩組比較，可見紅景天對(duì)梗死心肌的影響主要在梗死后第4天的梗死邊緣和梗死后第7天的梗死中央及梗死邊緣，都是上調(diào)的作用。5)而GDFl5在心肌內(nèi)的表達(dá)情況，兩組比較，紅景天組對(duì)心肌GDFl5表達(dá)的影響主要集中在4天

16、的梗死邊緣和7天的梗死遠(yuǎn)處，均為上調(diào)的作用。6)GDFl5在心梗后未用紅景天干預(yù)的情況下，梗死中央和梗死邊緣的表達(dá)都是在第14天時(shí)表達(dá)最高。而用紅景天干預(yù)后是第4天時(shí)這兩個(gè)部分的表達(dá)最高。無(wú)論是否用紅景天干預(yù)，在第1天和第7天都是梗死遠(yuǎn)處表達(dá)最高，其次是梗死邊緣，梗死中央表達(dá)最低。在第4天和第14天都是梗死邊緣表達(dá)最高，其次是梗死遠(yuǎn)處，梗死中央表達(dá)還是最低。7)ERK磷酸化情況：紅景天組在1天和4天時(shí)對(duì)梗死心肌不同部位ERKl／2磷酸化

17、情況影響較大。1天時(shí)紅景天組在梗死中央、邊緣和遠(yuǎn)處的表達(dá)均高于生理鹽水組。4天時(shí)，在梗死中央和邊緣較生理鹽水組高，而梗死遠(yuǎn)處生理鹽水組較紅景天組高。 結(jié)論：在急性心肌梗死后，HIFla、VEGFR2和和ETSl在心肌不同部位的表達(dá)不同。隨時(shí)間變化，在梗死區(qū)內(nèi)變化較小。在梗死邊緣和梗死遠(yuǎn)處都有上升趨勢(shì)。紅景天對(duì)梗死后心肌血管再生期的影響，主要集中在炎癥反應(yīng)期。紅景天對(duì)梗死中央、邊緣和遠(yuǎn)處均有不同程度的影響。對(duì)梗死邊緣的影響較大。G