紅景天苷對(duì)失重性和杜氏肌萎縮的影響及機(jī)制研究.pdf

1、一.紅景天苷對(duì)失重性肌萎縮形成的影響及機(jī)制研究
　　在航天飛行尤其是中長(zhǎng)期航天飛行中，微重力將導(dǎo)致失重性肌萎縮的發(fā)生，主要以抗重力肌如比目魚肌萎縮尤為嚴(yán)重，其特征性表現(xiàn)為肌肉重量丟失、肌纖維橫截面積下降，并伴隨慢肌纖維向快肌纖維類型轉(zhuǎn)變?，F(xiàn)有的物理對(duì)抗措施并不足以緩解失重性肌萎縮的發(fā)生，嚴(yán)重影響航天員在軌飛行任務(wù)的完成和返回地面后的健康恢復(fù)。面對(duì)我國(guó)空間站、載人登月等長(zhǎng)期空間飛行的巨大挑戰(zhàn)，亟需研發(fā)包括藥物在內(nèi)的新的有效防護(hù)對(duì)抗措

2、施。
　　我們前期的研究結(jié)果表明，尾懸吊模擬失重誘導(dǎo)的比目魚肌萎縮中，對(duì)骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育發(fā)揮重要調(diào)控作用的TGF-β1因子及下游關(guān)鍵信號(hào)介導(dǎo)因子Smad3被選擇性激活;敲除Smad3可選擇性抑制尾懸吊誘導(dǎo)的比目魚肌肌肉重量丟失、肌纖維萎縮和慢肌纖維向快肌纖維類型的轉(zhuǎn)變。以上結(jié)果提示Smad3可作為失重性肌萎縮對(duì)抗藥物篩選的作用靶點(diǎn)。天然植物紅景天及其有效活性成分紅景天苷可以抑制肝腎臟組織中TGF-β1的表達(dá)，但未見(jiàn)紅景天/紅景天苷對(duì)

3、骨骼肌中TGF-β1/Smad3通路表達(dá)影響的報(bào)道。
　　本研究以野生型C57BL/6小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，利用紅景天苷或同等劑量PBS灌胃28天后，尾懸吊14天誘導(dǎo)失重性肌萎縮，分析紅景天苷對(duì)失重性肌萎縮形成過(guò)程肌肉重量、肌纖維橫截面積、快慢肌纖維含量以及TGF-β/Smad3信號(hào)通路表達(dá)的影響，并探討Smad3在紅景天苷影響失重性肌萎縮形成中作用的調(diào)控機(jī)制，主要研究結(jié)果如下:
　　1、尾懸吊14天后，PBS處理組小鼠后肢背側(cè)肌

4、肉尤其是慢肌比目魚肌肌肉重量明顯減輕，肌纖維橫截面積顯著下降;紅景天苷處理選擇性抑制了尾懸吊誘導(dǎo)的慢肌比目魚肌重量的丟失及肌纖維橫截面積的下降，即對(duì)抗了尾懸吊誘導(dǎo)的比目魚肌及其肌纖維的萎縮。
　　2、在尾懸吊誘導(dǎo)的比目魚肌萎縮形成過(guò)程中，骨骼肌特異表達(dá)的泛素連接酶Atrogin-1及MuRF1的表達(dá)明顯增加;紅景天苷處理后明顯抑制了尾懸吊誘導(dǎo)的Atrogin-1及MuRF1的表達(dá)，提示紅景天苷對(duì)抗失重性肌萎縮的作用可能與抑制了泛素

5、蛋白酶體通路的激活有關(guān)。
　　3、尾懸吊14天后，PBS處理組小鼠比目魚肌慢肌纖維（MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱa）含量明顯減少，快肌纖維(MHC-Ⅱb)含量明顯增加;而紅景天苷處理組小鼠比目魚肌中MHC-Ⅱa含量在尾懸吊后未發(fā)生明顯改變，MHC-Ⅱb的含量也比PBS處理組顯著較少，說(shuō)明紅景天苷通過(guò)抑制尾懸吊誘導(dǎo)的MHC-Ⅱa減少和MHC-Ⅱb的增加顯著對(duì)抗了慢肌纖維向快肌纖維類型的轉(zhuǎn)變。
　　4、Western blot的結(jié)果表

6、明，紅景天苷處理后抑制了尾懸吊誘導(dǎo)慢肌纖維相關(guān)蛋白TroponinⅠ-SS的減少和快肌纖維相關(guān)蛋白TroponinⅠ-FS的增加，進(jìn)一步驗(yàn)證了紅景天苷對(duì)尾懸吊誘導(dǎo)的慢肌纖維向快肌纖維類型轉(zhuǎn)變的對(duì)抗作用。
　　5、尾懸吊誘導(dǎo)的比目魚肌萎縮后，TGF-β1/Smad3信號(hào)通路明顯激活，紅景天苷處理明顯抑制了尾懸吊誘導(dǎo)的該信號(hào)通路的激活。
　　6、在成功構(gòu)建攜帶有Atrogin-1啟動(dòng)子序列報(bào)告載體的基礎(chǔ)上，將Smad3表達(dá)質(zhì)粒與

7、pGL-3-Atrogin-1體內(nèi)共轉(zhuǎn)染，結(jié)果表明，骨骼肌內(nèi)過(guò)表達(dá)Smad3可以誘導(dǎo)pGL-3-Atrogin-1熒光素酶的表達(dá)增加，提示Smad3可以激活A(yù)trogin-1的轉(zhuǎn)錄水平。
　　7、利用生物信息學(xué)的比對(duì)結(jié)果表明，小鼠Atrogin1基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-2115～-2107區(qū)域存在一個(gè)可能的Smad3的結(jié)合位點(diǎn)，但ChIP的結(jié)果表明，在尾吊后的比目魚肌中，p-Smad3并未與Atrogin-1啟動(dòng)子區(qū)域的該位點(diǎn)結(jié)合，

8、該結(jié)果提示，尾吊時(shí)p-Smad3的激活并未對(duì)Atrogin-1發(fā)揮直接轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，而可能通過(guò)與其它蛋白相互作用的方式間接調(diào)控了Atrogin-1的表達(dá)。
　　8、目前已知的和Smad3存在相互作用的蛋白中，F(xiàn)OXO是唯一可以對(duì)Atrogin-1發(fā)揮直接轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的因子，ChIP-re-ChIP的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，尾懸吊誘導(dǎo)比目魚肌萎縮后，在Smad3抗體沉淀的DNA片段中可以檢測(cè)到FOXO對(duì)Atrogin-1啟動(dòng)子位點(diǎn)的結(jié)合，該結(jié)

9、果證明，在尾懸吊誘導(dǎo)的比目魚肌萎縮形成過(guò)程中，激活的p-Smad3是通過(guò)與FOXO結(jié)合間接發(fā)揮了對(duì)Atrogin-1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。
　　9、利用ChIP-re-ChIP的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，紅景天苷處理通過(guò)降低p-Smad3與FOXO在Atrogin-1啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合豐度，抑制尾懸吊誘導(dǎo)的Atrogin-1的表達(dá)增加。10、為了驗(yàn)證p-Sma3是否介導(dǎo)了紅景天苷對(duì)尾懸吊誘導(dǎo)的慢肌纖維向快肌纖維類型轉(zhuǎn)變的對(duì)抗作用，我們應(yīng)用Smad3基

10、因敲除小鼠(Smad3+/-)及其同窩出生的野生型小鼠（Smad3+/+）尾懸吊后證實(shí)，Smad3基因敲除小鼠同樣可以對(duì)抗尾懸吊誘導(dǎo)的MHC-Ⅱa減少和MHC-Ⅱb的增加，提示紅景天苷可能通過(guò)抑制尾懸吊誘導(dǎo)的p-Smad3的激活發(fā)揮了對(duì)肌纖維類型轉(zhuǎn)變的對(duì)抗作用。
　　11、在成功構(gòu)建攜帶有MHC-Ⅱa或MHC-Ⅱb啟動(dòng)子序列報(bào)告載體的基礎(chǔ)上，我們證實(shí)，TGF-β1刺激可以明顯抑制pGL-3-MHC-Ⅱa的熒光素酶表達(dá)，增強(qiáng)pGL-

11、3-MHC-Ⅱb的熒光素酶表達(dá);過(guò)表達(dá)Smad3后，TGF-β1對(duì)pGL-3-MHC-Ⅱa熒光素酶表達(dá)的抑制作用及對(duì)pGL-3-MHC-Ⅱb熒光素酶表達(dá)的增強(qiáng)的作用更加顯著，提示p-Smad3的激活可以抑制MHC-Ⅱa的轉(zhuǎn)錄而增強(qiáng)MHC-Ⅱb的轉(zhuǎn)錄。
　　12、利用生物信息學(xué)手段對(duì)大鼠和小鼠MHC-Ⅱa或MHC-Ⅱb轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游3000bp序列的比對(duì)結(jié)果表明，在MHC-Ⅱa和MHC-Ⅱb基因啟動(dòng)子區(qū)域各自存在3個(gè)和2個(gè)保守的S

12、mad結(jié)合位點(diǎn)(Smad binding element，SBE)。
　　13、利用ChIP的研究結(jié)果證實(shí)，p-Smad3可以直接與靠近MHC-Ⅱa或MHC-Ⅱb轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的SBE結(jié)合，分別位于MHC-Ⅱa基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-54～-44bp區(qū)域以及MHC-Ⅱb基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-630～-622bp區(qū)域。
　　14、利用點(diǎn)突變策略成功將pGL-3-MHC-Ⅱa和pGL-3-MHC-Ⅱb報(bào)告載體的上述SBE位點(diǎn)突變后，

13、逆轉(zhuǎn)了p-Smad3對(duì)MHC-Ⅱa和MHC-Ⅱb基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，證實(shí)p-Smad3調(diào)控MHC-Ⅱa和MHC-Ⅱb基因轉(zhuǎn)錄必需依賴同上述SBE位點(diǎn)的直接結(jié)合。
　　15、ChIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，紅景天苷處理后通過(guò)抑制尾懸吊誘導(dǎo)的p-Smad3的表達(dá)，降低p-Smad3對(duì)慢肌基因MHC-Ⅱa以及快肌基因MHC-Ⅱb啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合豐度，從而對(duì)抗了尾懸吊誘導(dǎo)的慢肌基因MHC-Ⅱa的減少和快肌基因MHC-Ⅱb的表達(dá)增加。
　　通過(guò)

14、以上研究證實(shí)，紅景天苷可以選擇性抑制模擬失重誘導(dǎo)的慢肌比目魚肌萎縮及其慢肌纖維向快肌纖維類型的轉(zhuǎn)變，并揭示了Smad3在紅景天苷對(duì)抗失重性肌萎縮形成過(guò)程中的調(diào)控作用，該研究不僅為失重性肌萎縮的防護(hù)對(duì)抗提供了有效的分子靶點(diǎn)，也為以紅景天苷為主要有效藥理活性成分的天然植物紅景天治療失重性肌萎縮提供了科學(xué)依據(jù)。
　　二.紅景天苷對(duì)杜氏肌萎縮動(dòng)物模型的治療作用研究
　　杜氏肌萎縮（Duchenne muscular dystroph

15、y, DMD）是由位于人類X染色體的dystrophin基因缺失導(dǎo)致的一種臨床嚴(yán)重致死性疾病。由于DMD患者肌纖維中缺失dystrophin，出生后肌肉的運(yùn)動(dòng)收縮，容易引起肌纖維反復(fù)損傷再生、持續(xù)性炎性反應(yīng)和纖維化等主要病理改變。TGF-β1因子的高表達(dá)被認(rèn)為在DMD骨骼肌纖維化形成中起著關(guān)鍵的作用。在本研究中，我們以DMD疾病公認(rèn)的mdx小鼠為研究對(duì)象，利用中藥紅景天活性成分紅景天苷抑制骨骼肌TGF-β1因子表達(dá)，并利用尾懸吊減少md

16、x肌肉運(yùn)動(dòng)收縮，探討中藥組分紅景天苷和物理制動(dòng)方法對(duì)DMD疾病模型mdx的治療作用。主要研究結(jié)果如下:
　　1、HE染色的結(jié)果證明，mdx小鼠腓腸肌炎性反應(yīng)劇烈;紅景天苷能明顯減輕mdx小鼠腓腸肌的炎性反應(yīng)，使炎性因子的表達(dá)恢復(fù)至正常野生型小鼠水平。
　　2、相比野生型小鼠，mdx小鼠腓腸肌成肌因子表達(dá)顯著增加;紅景天苷處理抑制了mdx小鼠腓腸肌內(nèi)成肌因子的表達(dá)，提示紅景天苷處理后減輕了腓腸肌內(nèi)的損傷修復(fù)反應(yīng)。
　　3

17、、相比野生型小鼠，mdx小鼠腓腸肌明顯纖維化、成纖維因子表達(dá)增加，尤其以collagenⅠα1增加最為明顯;紅景天苷明顯的抑制了纖維化形成及collagenⅠα1的表達(dá)。
　　4、相比野生型小鼠，mdx小鼠腓腸肌中慢肌纖維基因表達(dá)減少，快肌纖維基因表達(dá)增加;紅景天苷處理明顯抑制快肌纖維表達(dá)，該結(jié)果提示，紅景天苷可以抑制mdx小鼠骨骼肌中慢肌纖維向快肌纖維類型的轉(zhuǎn)變。
　　5、mdx小鼠腓腸肌中TGF-β1/Smad3信號(hào)通路

18、明顯激活;但紅景天苷處理明顯抑制了mdx小鼠腓腸肌內(nèi)TGF-β1/Smad3信號(hào)通路的表達(dá)，提示紅景天苷對(duì)mdx小鼠骨骼肌病理?yè)p傷的改善作用與抑制TGF-β1/Smad3信號(hào)通路的激活有關(guān)。
　　6、mdx小鼠后肢背側(cè)骨骼肌中以腓腸肌炎性反應(yīng)最為明顯，尾懸吊14天能明顯減輕mdx小鼠腓腸肌中的炎性反應(yīng)，減少中心核含量及壞死肌纖維的數(shù)目。
　　7、尾懸吊14天能引起mdx小鼠骨骼肌肌纖維的萎縮，該結(jié)果提示，通過(guò)尾懸吊減輕mdx