基于陽離子聚合物-DNA納米復(fù)合物微針給藥系統(tǒng)的研究.pdf

1、DNA疫苗是將含有編碼抗原基因的真核表達質(zhì)粒直接接種體內(nèi),在體內(nèi)表達相應(yīng)抗原,以刺激機體產(chǎn)生針對該抗原的免疫應(yīng)答,產(chǎn)生保護性免疫。它是在基因治療和轉(zhuǎn)基因技術(shù)基礎(chǔ)上產(chǎn)生的第三代疫苗,是疫苗的一次革命。但目前DNA疫苗的給藥系統(tǒng)比較單一,主要是質(zhì)粒DNA凍干粉針,肌注給藥后,DNA進入組織細胞,特別是到達樹狀突細胞(DCs)等抗原提呈細胞(antigen-presenting cells,APCs)的轉(zhuǎn)運效率較低,因而導(dǎo)致抗原表達水平低,免

2、疫效果不好。目前關(guān)鍵是在于缺乏高效低毒的DNA疫苗的傳遞系統(tǒng)。皮膚特別是在活性表皮層中存在著大量的樹狀突細胞(DCs)---郎格漢氏細胞(Langcrhans cells,500-1000 cells mm-2),這是一種高效的抗原提呈細胞(APCs),可產(chǎn)生很強的免疫效應(yīng),因此活性表皮層被看作疫苗接種的最佳部位。然而DNA疫苗這樣的親水性大分子藥物是無法穿透皮膚角質(zhì)層的屏障,并且皮膚內(nèi)的酶系會對DNA疫苗產(chǎn)生降解作用,而使抗原提呈細胞

3、無法捕獲DNA疫苗。為此我們設(shè)計了陽離子聚合物/DNA疫苗復(fù)合物微針給藥系統(tǒng)。微針(Microneedles)是指通過微電子機械工藝技術(shù)(MEMS)制作的,尺寸在微米級,長度100μm以上呈針狀的復(fù)雜結(jié)構(gòu),材料可以為硅、聚合物、金屬等。微針在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。微針用于藥物傳輸系統(tǒng)具有精確、無痛、高效、便利的優(yōu)勢。利用微針給藥系統(tǒng)可主動靶向于皮膚特定深度,即活性表皮層的郎格漢氏細胞。為了提高DNA疫苗在體內(nèi)的穩(wěn)定性,合成了基于聚乙

4、烯亞胺(PEI)的基因載體,選用兩親性的嵌段共聚物Pluronic(聚氧乙烯-聚環(huán)氧丙烷-聚氧乙烯嵌端共聚物)和Solutol(聚乙二醇-12羥基硬脂酸酯)修飾支鏈高分子量PEI,不但可以增加PEI/DNA復(fù)合物的穩(wěn)定性,屏蔽復(fù)合物表面的正電荷,減小其對細胞的毒性作用,還因為Pluronic和Solutol分子中含有疏水基團,對細胞具有一定的親和力,不會顯著降低DNA疫苗體內(nèi)外轉(zhuǎn)染效率。以乙肝DNA疫苗為模型藥物,考察了陽離子聚合物/D

5、NA疫苗復(fù)合物微針透皮給藥后的小鼠體內(nèi)免疫效果。 第一部分使用琥珀酰亞胺酯法活化非離子表面活性劑Pluronic或Solutol的末端羥基,得到活化率高,反應(yīng)活度大的產(chǎn)物。使用活化后的聚合物按不同比例對PEI進行修飾。經(jīng)過葡聚糖凝膠純化,超濾脫鹽,冷凍干燥,成功的合成了一系列不同修飾度(每個PEI分子上分別接枝1個、2個、5個、10個和20個Pluronic或Solutol)的Craft-PEI聚合物。1H-NMR結(jié)果顯示,本方

6、法合成的陽離子聚合物接枝率高,控制投藥量能定量地對PEI進行修飾,其接枝率與反應(yīng)時投藥量的摩爾比呈良好的線性關(guān)系,說明該合成方法比較穩(wěn)定、可靠,產(chǎn)率高,具有良好的可控性。1H-NMR圖譜中未見其它雜質(zhì)峰,證明這些陽離子聚合物的純度較高。 第二部分重點考察了陽離子接枝聚合物/DNA復(fù)合物的相關(guān)性質(zhì)。凝膠電泳阻滯分析結(jié)果顯示,完全阻滯DNA所需的N/P值隨著PEI修飾度的增加而增大,隨著修飾物分子量的減小而減小。本實驗所制備的PEI

7、/DNA、graft-PEI/DNA復(fù)合物粒徑在60-400 nm范圍內(nèi)。隨著復(fù)合物N/P值的增加,粒徑有減小的趨勢。高分子量的修飾物,在高修飾度時復(fù)合物的粒徑明顯增大。復(fù)合物的zeta電位隨N/P值的增加而增加；相同N/P值的復(fù)合物,其zeta電位隨表面活性劑接枝數(shù)的增加而減少；復(fù)合物的zeta電位在相同修飾度且相同N/P值時,隨表面活性劑分子量的減小而略有增加。MTT法測定細胞毒性的結(jié)果表明,使用表面活性劑修飾PEI可以不同程度地降

8、低其細胞毒性,在低濃度時每個PEI接枝一個表面活性劑的分子即可顯著降低細胞毒性。在高濃度時每個PEI接枝≥5個表面活性劑分子則可顯著降低細胞毒性。 第三部分評價了陽離子接枝聚合物/DNA復(fù)合物體內(nèi)外轉(zhuǎn)染效果。選用了兩種分別編碼綠色熒光蛋白和蟲熒光素酶的質(zhì)粒。為了獲得蟲熒光素酶在體內(nèi)較高的表達,將CMV啟動子克隆到蟲熒光素酶表達質(zhì)粒pGL3-basic Luciferase Reporter vector中,構(gòu)建成重組的pGL3-

9、CMV Luciferase Reporter vector。陽離子接枝聚合物/DNA復(fù)合物在Hela細胞上的轉(zhuǎn)染效果表明,低分子量的L61和Solutol修飾的PEI在低修飾度時不會顯著地降低轉(zhuǎn)染效果,低P123修飾度的PEI的最佳轉(zhuǎn)染效果與未修飾的PEI相似。隨著表面活性劑分子量增大,接枝率增加,其最佳轉(zhuǎn)染效率隨之下降。ICR小鼠尾靜脈注射復(fù)合物,測定各個臟器中蟲熒光素酶的表達,除了肺部外,低修飾度的PEI最佳轉(zhuǎn)染效率顯著優(yōu)于未修飾

10、的PEI。 第四部分使用微電機技術(shù)制備了SU-8聚合物微針,考察了微針的機械強度,結(jié)果表明該微針陣列可以容易地穿破鋁箔和離體皮膚,并具有一定的堅韌度,不易折斷。考察了微針對不同藥物的體外透皮促進作用。首先考察了四種不同油水分配系數(shù)的小分子藥物(吲哚美辛、酮洛芬、美索巴莫、更昔洛韋),結(jié)果表明吲哚美辛的皮膚滲透速率增加4.05倍,酮洛芬的皮膚滲透速率增加4.77倍,美索巴莫的皮膚滲透速率增加6.06倍,更昔洛韋的皮膚滲透速率增加1

11、2.49倍,說明logP值是影響藥物經(jīng)微針透皮傳遞速率的重要因素,微針對于水溶性藥物的透皮促進作用較脂溶性藥物更加有利。又考察了四種不同分子量的生物大分子藥物(胰島素、溶菌酶、卵清白蛋白、人血清白蛋白),結(jié)果表明與無法透過完整的皮膚相比,生物大分子藥物可以透過微針陣列處理過的皮膚,經(jīng)皮滲透速率可以達到小分子藥物的水平。生物大分子藥物分子量與經(jīng)皮滲透速率成反比。 第五部分主要考察了DNA疫苗的體內(nèi)免疫效果。通過細胞吞噬實驗證明了修

12、飾后的PEI其細胞吞噬過程未發(fā)生改變?？笵NAase I的保護實驗表明復(fù)合物可以有效地保護DNA不被降解。微針陣列可刺入小鼠活體皮膚,并在皮膚表皮層產(chǎn)生幾十微米的孔洞,提供了復(fù)合物穿透角質(zhì)層的通道。以乙肝疫苗為模型藥物,考察體內(nèi)免疫效果,分別測定血清中的抗體滴度,脾細胞分泌的細胞因子(γ-INF,IL-4),及脾細胞的增殖。與乙肝DNA疫苗復(fù)合物肌注和DNA疫苗水溶液肌注相比,陽離子聚合物/DNA疫苗復(fù)合物微針經(jīng)皮給藥在第4周后可以顯著