雙向基因調(diào)控黑素細(xì)胞凋亡的聚陽離子納米復(fù)合物靶向給藥系統(tǒng)的研究.pdf

1、白癜風(fēng)(Vitiligo)是一種由于黑素細(xì)胞特異性損害而致色素脫失的獲得性皮膚病，癥狀為皮膚出現(xiàn)局限性或泛發(fā)性色素脫失斑，此病由皮膚和毛囊的黑色素脫失所引起，是一種容易診斷而難于治療的皮膚病。近期研究發(fā)現(xiàn)，黑素細(xì)胞生長存活缺陷，已成為白癜風(fēng)皮損中黑素細(xì)胞丟失的一個(gè)主要原因，因此，抑制黑素細(xì)胞凋亡是白癜風(fēng)治療的一個(gè)重要潛在靶點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，在黑素細(xì)胞中，Bc1-2是最主要的細(xì)胞凋亡抑制基因，Bax(Bc1-2 associated Xpro

2、tein，Bc1-2相關(guān)蛋白X)則是最主要的細(xì)胞凋亡促進(jìn)基因，因此，將Bc1-2質(zhì)粒與Bax的小干擾RNA片段以一定的比例導(dǎo)入到黑素細(xì)胞內(nèi)，可有效地控制黑素細(xì)胞凋亡。
　　 本課題的研究目標(biāo)是利用RNA干擾/DNA表達(dá)的雙向基因調(diào)控技術(shù)，依靠α-黑素細(xì)胞刺激(α-melanocyte-stimulating hormone，α-MSH)與黑素細(xì)胞表面的黑皮素-1受體(melanocortin 1 receptor，MC-1R)的

3、特異性結(jié)合作用，以低分子量聚乙烯亞胺(low molecular weight polyethyleneimine，LMWPEI)為基因載體，構(gòu)建一個(gè)靶向于黑素細(xì)胞的聚陽離子基因納米復(fù)合物給藥系統(tǒng)。主要研究內(nèi)容分為兩部分：一方面，利用具有親水親脂兩性基團(tuán)的普朗尼克(Pluronic)連接低分子量聚乙烯亞胺，形成高分子聚合物，探討其分子量大小、結(jié)構(gòu)特征、水解能力、細(xì)胞毒性及轉(zhuǎn)染效率等性質(zhì)，以期得到一個(gè)更加安全、有效的陽離子聚合物基因載體；

4、同時(shí)，在該載體上連接黑皮素-1受體的配體，作為靶向頭基，實(shí)現(xiàn)黑素細(xì)胞的靶向；另一方面，利用RNA干擾/DNA表達(dá)的雙向基因調(diào)控技術(shù)，將小干擾RNA片段/質(zhì)粒包裹于上述載體，在抑制bax過表達(dá)的同時(shí)促進(jìn)bc1-2表達(dá)，從而達(dá)到抑制黑素細(xì)胞調(diào)亡的目的，為白癜風(fēng)等因黑素細(xì)胞特異性損害而致的疾病提供一條新的有效的治療途徑。本文主要從以下幾部分進(jìn)行研究：
　　 第一部分，低分子量聚乙烯亞胺陽離子聚合物的合成及聚陽離子/DNA納米復(fù)合物的理

5、化性質(zhì)、體外轉(zhuǎn)染和毒性評價(jià)。使用三光氣+N-羥基琥珀亞酰胺法將不同種類Pluronic雙端羥基活化并與低分子量PEI反應(yīng)，利用凝膠滲透層析色譜法(GPC)對所得的產(chǎn)物進(jìn)行分子量測定，利用核磁共振(NMR)對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行測定，測定聚合物在外界環(huán)境下的水解能力，制備不同質(zhì)量比的聚陽離子/DNA納米復(fù)合物，利用馬爾文微粒測定儀等測定影響復(fù)合物粒徑、Zeta電位和穩(wěn)定性的因素；使用瓊脂糖凝膠電泳考察不同質(zhì)量比條件下陽離子聚合物對DNA的濃縮能力，

6、考察聚陽離子/DNA復(fù)合物抗酶解能力，選擇He1a細(xì)胞株進(jìn)行體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)；采用CCK-8法測定細(xì)胞毒性。
　　 第二部分，Bc1-2/Bax的雙向基因策略調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的體外評價(jià)。構(gòu)建Bc1-2表達(dá)質(zhì)粒，驗(yàn)證其體外表達(dá)效率；參考文獻(xiàn)進(jìn)行小干擾RNA片段合成并驗(yàn)證，獲得有效的Bax干擾小RNA；采用優(yōu)化比例的混合核酸，經(jīng)聚陽離子納米復(fù)合物包裹后體外轉(zhuǎn)染黑素細(xì)胞，進(jìn)行基因表達(dá)與凋亡評價(jià)。
　　 第三部分，使用α-黑素細(xì)胞刺激素

7、修飾第一部分所得聚合物，得到含有靶向頭基的載體材料；將包裹了DNA和RNA的聚陽離子納米復(fù)合物與黑素細(xì)胞在體外培育，對其粒徑及Zeta電位進(jìn)行測定，并考察其穩(wěn)定性，體內(nèi)外靶向性，以及促進(jìn)黑素細(xì)胞增殖的效果。
　　 第四部分，雙向基因調(diào)控的聚陽離子納米復(fù)合物抗凋亡作用研究及安全性評價(jià)。構(gòu)建白癜風(fēng)的小鼠動(dòng)物模型；通過皮膚亮度效果評價(jià)和黑素細(xì)胞數(shù)量變化評價(jià)其治療效果；通過動(dòng)物血常規(guī)及肝、腎功能檢測，病理組織的免疫組化檢測，給藥系統(tǒng)溶血

8、性考察等評價(jià)該復(fù)合物的安全性。
　　 綜上所述，為了抑制黑素細(xì)胞的凋亡，本課題通過基因治療的方法，利用RNA干擾/DNA表達(dá)的雙向基因調(diào)控技術(shù)，以黑皮素-1受體介導(dǎo)的靶向于黑素細(xì)胞的低分子量聚乙烯亞胺陽離子聚合物為載體，將外源的基因?qū)肷锛?xì)胞內(nèi)，使Bc1-2的表達(dá)提高的同時(shí)，抑制Bax基因的表達(dá)，從而起到防止黑素細(xì)胞凋亡的作用，保證其在體內(nèi)發(fā)揮正常的生理作用。這種利用雙向基因調(diào)控來抑制黑素細(xì)胞凋亡的研究在國外未見到相關(guān)報(bào)道，同