大蒜素和腫瘤抑制基因CYLD對(duì)心肌肥大以及心力衰竭的調(diào)控作用.pdf

1、第一部分大蒜素通過(guò)活性氧依賴(lài)的信號(hào)途徑抑制心肌肥大和心力衰竭
　　 大量文獻(xiàn)表明活性氧(ROS)與病理性心肌肥大密切相關(guān)，多種致心肌肥大因素可引起ROS的產(chǎn)量增加，包括:血管緊張素II(Ang II)，苯腎上腺素、內(nèi)皮素-1(ET-1)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)以及機(jī)械牽拉刺激。已有多個(gè)研究表明ROS參與了心肌肥大的形成。ROS與心肌肥大的多條信號(hào)通路密切相關(guān)。ROS可直接或間接啟動(dòng)蛋白激酶C(PKC)、ERK1/2、p38

2、、JNK、凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1(ASK-1)、P13K、Akt和核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)及鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶等通路。因此，阻斷過(guò)多的ROS可有效的抑制心肌肥大。
　　 大蒜(Allium sativum L.)其作為調(diào)味品在民間廣泛應(yīng)用，現(xiàn)代科學(xué)證明大蒜具有多種有益健康的生物活性:抗氧化、抗細(xì)菌、抗寄生蟲(chóng)、降低血脂和抑制血小板聚集等。大蒜的活性成份之一:大蒜素，被證明與大蒜的主要生物活性相關(guān)。大蒜素通過(guò)有效地清除羥自由基發(fā)揮其抗

3、氧化作用，從而降低脂質(zhì)過(guò)氧化。大蒜素可降低ROS的對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，并可提高細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽含量以保護(hù)細(xì)胞免于氧化應(yīng)激損傷。大蒜素的抗氧化作用可能通過(guò)抑制一氧化氮(NO)的活性來(lái)產(chǎn)生。在心肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中，大蒜素可抑制由細(xì)菌脂多糖(LPS)升高的誘導(dǎo)性一氧化氮合成酶(iNOS)活性。Sun等報(bào)道在肺性高血壓大鼠中，大蒜素通過(guò)保護(hù)冠狀內(nèi)皮功能以抑制右心室肥大。然而，大蒜素作為有效的抗氧化劑，關(guān)于大蒜素是否對(duì)心肌肥大以及心力衰竭的發(fā)展有影響

4、，目前尚未有任何報(bào)道。
　　 研究目的:在壓力過(guò)負(fù)荷以及Ang II分別誘導(dǎo)的心肌肥大動(dòng)物模型與細(xì)胞模型中，評(píng)價(jià)大蒜素對(duì)心肌肥大以及心功能的影響，然后通過(guò)對(duì)活性氧的水平、心肌肥大相關(guān)信號(hào)通路的改變、炎癥反應(yīng)以及心肌纖維化的檢測(cè)，進(jìn)一步探討大蒜素調(diào)控心肌肥大的機(jī)制。
　　 研究方法:利用1μM Ang II誘導(dǎo)原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞發(fā)生肥大。采用主動(dòng)脈縮窄(aortic banding，AB)構(gòu)建壓力過(guò)負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥大模型，

5、使用大蒜素處理后通過(guò)檢測(cè)心臟/體重比率，利用超聲心動(dòng)圖及病理學(xué)方法確定其對(duì)心肌肥大、心功能和心肌纖維化的影響。利用。ROS測(cè)定評(píng)價(jià)大蒜素對(duì)氧化應(yīng)激的調(diào)控作用，用Real time PCR和western blot檢測(cè)心肌肥大與纖維化相關(guān)基因mRNA與蛋白的表達(dá)，以及ROS相關(guān)信號(hào)通路的改變。
　　 結(jié)果:
　　 1.在Ang II處理的心肌細(xì)胞中，大蒜素劑量依賴(lài)性地抑制由Ang II引起蛋白合成增多與心肌細(xì)胞表面積增大，

6、并對(duì)胚胎期基因β-肌球蛋白重鏈(β-MHC)、心房利鈉肽(ANP)和腦鈉肽(BNP)的蛋白表達(dá)有明顯抑制作用。
　　 2.在壓力過(guò)負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥大模型中，大蒜素處理使心臟變小、重量減輕、心肌細(xì)胞面積減小。超聲心動(dòng)圖顯示，與未處理組相比，手術(shù)8周后大蒜素可明顯減低心臟直徑(LVEDD:4.12±0.05mm vs5.84±0.04mm；LVESD:2.69±0.04.mm vs3.63±0.02 mm)，減輕心室壁的增厚(IVS

7、d:0.96±0.03mm vs1.68±0.04.mm；PWd:0.78±0.03mm vs1.32±0.04 mm)，降低胚胎期基因β-MHC、ANP和BNP表達(dá)。
　　 3.在心肌細(xì)胞中，大蒜素劑量依賴(lài)性減少Ang II誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生:在壓力過(guò)負(fù)荷8周后，大蒜素也可降低組織內(nèi)ROS的水平。
　　 4.在Ang II刺激的心肌細(xì)胞以及主動(dòng)脈縮窄術(shù)后的小鼠中，大蒜素顯著降低心肌肥大相關(guān)的MAPK信號(hào)通路分子ERK1/

8、2，JNK1/2的磷酸化，也對(duì)P13K/Akt/GSK3β信號(hào)通路分子p85、Akt和GSK3β的活化有明顯的抑制效應(yīng)。
　　 5.大蒜素降低壓力過(guò)負(fù)荷后心臟中炎性細(xì)胞因子TNF-α，白介素-6(IL-6)和單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)的mRNA表達(dá)。
　　 6.大蒜素可明顯降低手術(shù)后8周的心肌膠原含量，抑制壓力過(guò)負(fù)荷后提高的膠原合成，并且對(duì)纖維化標(biāo)志物轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)、Collal、Colla3和

9、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)的mRNA水平，以及CTGF和膠原I、III的蛋白水平起明顯的負(fù)調(diào)控作用。大蒜素還可對(duì)心肌纖維化相關(guān)的。TGFβ/Smad通路分子Smad2和Smad3的激活產(chǎn)生抑制作用。
　　 7.利用抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)和二亞苯基碘鎓(DPI)處理，與大蒜素的結(jié)果類(lèi)似，可明顯降低Ang II誘導(dǎo)的蛋白合成以及ERK1/2、JNK1/2和Akt的激活:同時(shí)還可負(fù)調(diào)控膠原合成以及纖維化相關(guān)Smad2和S

10、mad3的磷酸化的激活。
　　 結(jié)論:當(dāng)前研究表明，大蒜素在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中均可明顯抑制心肌肥大、抑制炎癥反應(yīng)、降低心肌纖維化并保護(hù)心功能，此作用的機(jī)制可能為大蒜素減少ROS的產(chǎn)生，阻斷ROS引起的心肌肥大信號(hào)通路以及心肌纖維化信號(hào)通路的激活。
　　 第二部分心臟特異性過(guò)表達(dá)腫瘤抑制基因CYLD促進(jìn)壓力過(guò)負(fù)荷誘導(dǎo)的心臟擴(kuò)張和心力衰竭
　　 CYLD作為人體內(nèi)一個(gè)重要的腫瘤抑制因子，廣泛表達(dá)于多種器官組織。若其等位基因

11、突變或缺失將導(dǎo)致CYLD蛋白功能的缺陷，從而引起各種良性皮膚腫瘤的發(fā)生，如多發(fā)性家族性毛發(fā)上皮瘤(FC)，多發(fā)性家族性毛發(fā)上皮瘤(MFT)和Brooke-Spiegler綜合癥(BSS)。研究表明，CYLD作為去泛素化酶家族的一員，可將其特異性底物的第48位賴(lài)氨酸(K48)和K63多聚泛素鏈去除。由于CYLD對(duì)K63多聚泛素鏈的蛋白水解作用比其對(duì)K48的作用要高接近100倍，所以，CYLD的去泛素化作用主要表現(xiàn)在它對(duì)底物K63多聚泛素鏈

12、的去除。根據(jù)不同的泛素化類(lèi)型，被泛素化的蛋白的結(jié)局也不盡相同。K48多聚泛素鏈可以促使泛素化的底物被泛素-蛋白酶體系統(tǒng)降解。然而K63多聚泛素化則與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，DNA修復(fù)核轉(zhuǎn)位，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞周期以及免疫反應(yīng)等相關(guān)。因此，CYLD通過(guò)對(duì)K63多聚泛素鏈的移除，可以在多種病理生理過(guò)程中發(fā)揮重要功能。現(xiàn)已證明多個(gè)分子是CYLD的特異性底物，CYLD通過(guò)對(duì)NF-κB信號(hào)通路中TNF受體相關(guān)因子(TRAF)2、TRAF6、TRAF7和NF-κB必

13、須調(diào)節(jié)子(NEMO)的κ63多聚泛素鏈的去泛素化作用，而抑制NF-κB的激活。通過(guò)對(duì)NF-κB的負(fù)調(diào)控作用，CYLD可發(fā)揮多種作用，如抑制炎癥、參與胸腺細(xì)胞的發(fā)育、維持T細(xì)胞和B細(xì)胞的正常功能等。去泛素化酶在應(yīng)激狀態(tài)下的心臟中起重要作用。研究表明，A20，去泛素化酶家族的另一成員，可抑制心肌肥大并在心肌梗死中起保護(hù)作用。腫瘤抑制基因PTEN和p53也與心肌肥大相關(guān)。由于去泛素化酶和腫瘤抑制基因在心肌肥大的過(guò)程中都具有重要的作用，因此，推

14、論CYLD有可能參與了心肌肥大與心力衰竭的調(diào)控。
　　 研究目的:利用正常的人CYLD心臟特異性轉(zhuǎn)基因小鼠(CYLD-TG)和無(wú)去泛素化酶活性的人CYLD心臟特異性轉(zhuǎn)基因小鼠(Mu-CYLD)，在壓力過(guò)負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥大模型中，評(píng)價(jià)CYLD對(duì)心肌肥大反應(yīng)和心功能的影響。然后通過(guò)對(duì)心肌細(xì)胞凋亡以及心肌纖維化的檢測(cè)，探討了CYLD導(dǎo)致心力衰竭的原因。
　　 研究方法:通過(guò)構(gòu)建心臟特異性的轉(zhuǎn)基因小鼠，利用主動(dòng)脈縮窄模型，在手術(shù)

15、后8周檢測(cè)心臟重量比率，并通過(guò)蘇木素&伊紅染色、超聲心動(dòng)圖、心室壓力容量測(cè)定以確定CYLD對(duì)心肌肥大和心功能的調(diào)控作用。采用天狼星紅染色檢測(cè)心肌纖維化，用Real time PCR和western blot檢測(cè)心肌肥大和纖維化相關(guān)基因mRNA和蛋白表達(dá)。使用免疫組織化學(xué)檢測(cè)信號(hào)分子的核轉(zhuǎn)移情況，TUNEL法測(cè)定心肌細(xì)胞凋亡率。
　　 結(jié)果:
　　 1.人CYLD僅在轉(zhuǎn)基因小鼠的心臟中特異性表達(dá)，在CYLD-TG和Mu-C

16、YLD小鼠中，分別選取轉(zhuǎn)基因表達(dá)量較低的系進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　 2.在壓力過(guò)負(fù)荷8周后，CYLD-TG和Mu-CYLD小鼠心臟重量比率、心肌細(xì)胞橫截面積與野牛型小鼠(WT)相比無(wú)差別，心肌肥大的標(biāo)志性因子:Myh-6，Myh-7和ACATl的mRNA水平在手術(shù)后三組之間也無(wú)顯著性差異。
　　 3.與WT組相比，術(shù)后8周CYLD-TG組心臟直徑明顯增加，左心室容量也顯著增大。并且CYLD-TG組心功能較WT組明顯降低，表現(xiàn)

17、為縮短分?jǐn)?shù)(FS％)和射血分?jǐn)?shù)(EF)的下降。ANP和BNP的mRNA表達(dá)在CYLD-TG組中上調(diào)。然而在Mu-CYLD組中，以上各項(xiàng)指標(biāo)與WT組接近。
　　 4.壓力過(guò)負(fù)荷8周后，過(guò)表達(dá)CYLD顯著促進(jìn)心肌細(xì)胞的凋亡，凋亡率較WT組明顯升高(156±19/105 vs99±9/105)。Mu-CYLD組凋亡率與WT組無(wú)差異(87±14/105)。促凋亡蛋白Caspase9的蛋白表達(dá)水平在CYLD-TG組中比其他兩組明顯上調(diào)。<

18、br>　　 5.與WT組相比較，CYLD導(dǎo)致明顯加重的心肌間質(zhì)纖維化，心臟膠原百分比升高，促纖維化因子CTGF表達(dá)升高。并且，過(guò)表達(dá)CYLD可以誘導(dǎo)明顯的Smad3激活及促進(jìn)其核轉(zhuǎn)位。而Mu-CYLD組心肌纖維化水平與WT組無(wú)差異。
　　 結(jié)論:目前的研究表明，在壓力過(guò)負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥大中，CYLD促進(jìn)心臟擴(kuò)張，惡化心功能，加速心臟由心肌肥大代償期向心力衰竭的轉(zhuǎn)換。其機(jī)制可能與CYLD促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡，加重心肌纖維化相關(guān)，并且