大蒜素和腫瘤抑制基因CYLD對心肌肥大以及心力衰竭的調(diào)控作用.pdf

1、第一部分大蒜素通過活性氧依賴的信號途徑抑制心肌肥大和心力衰竭
　　 大量文獻表明活性氧(ROS)與病理性心肌肥大密切相關，多種致心肌肥大因素可引起ROS的產(chǎn)量增加，包括:血管緊張素II(Ang II)，苯腎上腺素、內(nèi)皮素-1(ET-1)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)以及機械牽拉刺激。已有多個研究表明ROS參與了心肌肥大的形成。ROS與心肌肥大的多條信號通路密切相關。ROS可直接或間接啟動蛋白激酶C(PKC)、ERK1/2、p38

2、、JNK、凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1(ASK-1)、P13K、Akt和核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)及鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶等通路。因此，阻斷過多的ROS可有效的抑制心肌肥大。
　　 大蒜(Allium sativum L.)其作為調(diào)味品在民間廣泛應用，現(xiàn)代科學證明大蒜具有多種有益健康的生物活性:抗氧化、抗細菌、抗寄生蟲、降低血脂和抑制血小板聚集等。大蒜的活性成份之一:大蒜素，被證明與大蒜的主要生物活性相關。大蒜素通過有效地清除羥自由基發(fā)揮其抗

3、氧化作用，從而降低脂質(zhì)過氧化。大蒜素可降低ROS的對內(nèi)皮細胞的損傷，并可提高細胞內(nèi)谷胱甘肽含量以保護細胞免于氧化應激損傷。大蒜素的抗氧化作用可能通過抑制一氧化氮(NO)的活性來產(chǎn)生。在心肌細胞和巨噬細胞中，大蒜素可抑制由細菌脂多糖(LPS)升高的誘導性一氧化氮合成酶(iNOS)活性。Sun等報道在肺性高血壓大鼠中，大蒜素通過保護冠狀內(nèi)皮功能以抑制右心室肥大。然而，大蒜素作為有效的抗氧化劑，關于大蒜素是否對心肌肥大以及心力衰竭的發(fā)展有影響

4、，目前尚未有任何報道。
　　 研究目的:在壓力過負荷以及Ang II分別誘導的心肌肥大動物模型與細胞模型中，評價大蒜素對心肌肥大以及心功能的影響，然后通過對活性氧的水平、心肌肥大相關信號通路的改變、炎癥反應以及心肌纖維化的檢測，進一步探討大蒜素調(diào)控心肌肥大的機制。
　　 研究方法:利用1μM Ang II誘導原代培養(yǎng)的心肌細胞發(fā)生肥大。采用主動脈縮窄(aortic banding，AB)構建壓力過負荷誘導的心肌肥大模型，

5、使用大蒜素處理后通過檢測心臟/體重比率，利用超聲心動圖及病理學方法確定其對心肌肥大、心功能和心肌纖維化的影響。利用。ROS測定評價大蒜素對氧化應激的調(diào)控作用，用Real time PCR和western blot檢測心肌肥大與纖維化相關基因mRNA與蛋白的表達，以及ROS相關信號通路的改變。
　　 結果:
　　 1.在Ang II處理的心肌細胞中，大蒜素劑量依賴性地抑制由Ang II引起蛋白合成增多與心肌細胞表面積增大，

6、并對胚胎期基因β-肌球蛋白重鏈(β-MHC)、心房利鈉肽(ANP)和腦鈉肽(BNP)的蛋白表達有明顯抑制作用。
　　 2.在壓力過負荷誘導的心肌肥大模型中，大蒜素處理使心臟變小、重量減輕、心肌細胞面積減小。超聲心動圖顯示，與未處理組相比，手術8周后大蒜素可明顯減低心臟直徑(LVEDD:4.12±0.05mm vs5.84±0.04mm；LVESD:2.69±0.04.mm vs3.63±0.02 mm)，減輕心室壁的增厚(IVS

7、d:0.96±0.03mm vs1.68±0.04.mm；PWd:0.78±0.03mm vs1.32±0.04 mm)，降低胚胎期基因β-MHC、ANP和BNP表達。
　　 3.在心肌細胞中，大蒜素劑量依賴性減少Ang II誘導的ROS產(chǎn)生:在壓力過負荷8周后，大蒜素也可降低組織內(nèi)ROS的水平。
　　 4.在Ang II刺激的心肌細胞以及主動脈縮窄術后的小鼠中，大蒜素顯著降低心肌肥大相關的MAPK信號通路分子ERK1/

8、2，JNK1/2的磷酸化，也對P13K/Akt/GSK3β信號通路分子p85、Akt和GSK3β的活化有明顯的抑制效應。
　　 5.大蒜素降低壓力過負荷后心臟中炎性細胞因子TNF-α，白介素-6(IL-6)和單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)的mRNA表達。
　　 6.大蒜素可明顯降低手術后8周的心肌膠原含量，抑制壓力過負荷后提高的膠原合成，并且對纖維化標志物轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)、Collal、Colla3和

9、結締組織生長因子(CTGF)的mRNA水平，以及CTGF和膠原I、III的蛋白水平起明顯的負調(diào)控作用。大蒜素還可對心肌纖維化相關的。TGFβ/Smad通路分子Smad2和Smad3的激活產(chǎn)生抑制作用。
　　 7.利用抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)和二亞苯基碘鎓(DPI)處理，與大蒜素的結果類似，可明顯降低Ang II誘導的蛋白合成以及ERK1/2、JNK1/2和Akt的激活:同時還可負調(diào)控膠原合成以及纖維化相關Smad2和S

10、mad3的磷酸化的激活。
　　 結論:當前研究表明，大蒜素在體內(nèi)外實驗中均可明顯抑制心肌肥大、抑制炎癥反應、降低心肌纖維化并保護心功能，此作用的機制可能為大蒜素減少ROS的產(chǎn)生，阻斷ROS引起的心肌肥大信號通路以及心肌纖維化信號通路的激活。
　　 第二部分心臟特異性過表達腫瘤抑制基因CYLD促進壓力過負荷誘導的心臟擴張和心力衰竭
　　 CYLD作為人體內(nèi)一個重要的腫瘤抑制因子，廣泛表達于多種器官組織。若其等位基因

11、突變或缺失將導致CYLD蛋白功能的缺陷，從而引起各種良性皮膚腫瘤的發(fā)生，如多發(fā)性家族性毛發(fā)上皮瘤(FC)，多發(fā)性家族性毛發(fā)上皮瘤(MFT)和Brooke-Spiegler綜合癥(BSS)。研究表明，CYLD作為去泛素化酶家族的一員，可將其特異性底物的第48位賴氨酸(K48)和K63多聚泛素鏈去除。由于CYLD對K63多聚泛素鏈的蛋白水解作用比其對K48的作用要高接近100倍，所以，CYLD的去泛素化作用主要表現(xiàn)在它對底物K63多聚泛素鏈

12、的去除。根據(jù)不同的泛素化類型，被泛素化的蛋白的結局也不盡相同。K48多聚泛素鏈可以促使泛素化的底物被泛素-蛋白酶體系統(tǒng)降解。然而K63多聚泛素化則與信號轉(zhuǎn)導，DNA修復核轉(zhuǎn)位，信號轉(zhuǎn)導，細胞周期以及免疫反應等相關。因此，CYLD通過對K63多聚泛素鏈的移除，可以在多種病理生理過程中發(fā)揮重要功能?，F(xiàn)已證明多個分子是CYLD的特異性底物，CYLD通過對NF-κB信號通路中TNF受體相關因子(TRAF)2、TRAF6、TRAF7和NF-κB必

13、須調(diào)節(jié)子(NEMO)的κ63多聚泛素鏈的去泛素化作用，而抑制NF-κB的激活。通過對NF-κB的負調(diào)控作用，CYLD可發(fā)揮多種作用，如抑制炎癥、參與胸腺細胞的發(fā)育、維持T細胞和B細胞的正常功能等。去泛素化酶在應激狀態(tài)下的心臟中起重要作用。研究表明，A20，去泛素化酶家族的另一成員，可抑制心肌肥大并在心肌梗死中起保護作用。腫瘤抑制基因PTEN和p53也與心肌肥大相關。由于去泛素化酶和腫瘤抑制基因在心肌肥大的過程中都具有重要的作用，因此，推

14、論CYLD有可能參與了心肌肥大與心力衰竭的調(diào)控。
　　 研究目的:利用正常的人CYLD心臟特異性轉(zhuǎn)基因小鼠(CYLD-TG)和無去泛素化酶活性的人CYLD心臟特異性轉(zhuǎn)基因小鼠(Mu-CYLD)，在壓力過負荷誘導的心肌肥大模型中，評價CYLD對心肌肥大反應和心功能的影響。然后通過對心肌細胞凋亡以及心肌纖維化的檢測，探討了CYLD導致心力衰竭的原因。
　　 研究方法:通過構建心臟特異性的轉(zhuǎn)基因小鼠，利用主動脈縮窄模型，在手術

15、后8周檢測心臟重量比率，并通過蘇木素&伊紅染色、超聲心動圖、心室壓力容量測定以確定CYLD對心肌肥大和心功能的調(diào)控作用。采用天狼星紅染色檢測心肌纖維化，用Real time PCR和western blot檢測心肌肥大和纖維化相關基因mRNA和蛋白表達。使用免疫組織化學檢測信號分子的核轉(zhuǎn)移情況，TUNEL法測定心肌細胞凋亡率。
　　 結果:
　　 1.人CYLD僅在轉(zhuǎn)基因小鼠的心臟中特異性表達，在CYLD-TG和Mu-C

16、YLD小鼠中，分別選取轉(zhuǎn)基因表達量較低的系進行后續(xù)實驗。
　　 2.在壓力過負荷8周后，CYLD-TG和Mu-CYLD小鼠心臟重量比率、心肌細胞橫截面積與野牛型小鼠(WT)相比無差別，心肌肥大的標志性因子:Myh-6，Myh-7和ACATl的mRNA水平在手術后三組之間也無顯著性差異。
　　 3.與WT組相比，術后8周CYLD-TG組心臟直徑明顯增加，左心室容量也顯著增大。并且CYLD-TG組心功能較WT組明顯降低，表現(xiàn)

17、為縮短分數(shù)(FS％)和射血分數(shù)(EF)的下降。ANP和BNP的mRNA表達在CYLD-TG組中上調(diào)。然而在Mu-CYLD組中，以上各項指標與WT組接近。
　　 4.壓力過負荷8周后，過表達CYLD顯著促進心肌細胞的凋亡，凋亡率較WT組明顯升高(156±19/105 vs99±9/105)。Mu-CYLD組凋亡率與WT組無差異(87±14/105)。促凋亡蛋白Caspase9的蛋白表達水平在CYLD-TG組中比其他兩組明顯上調(diào)。<

18、br>　　 5.與WT組相比較，CYLD導致明顯加重的心肌間質(zhì)纖維化，心臟膠原百分比升高，促纖維化因子CTGF表達升高。并且，過表達CYLD可以誘導明顯的Smad3激活及促進其核轉(zhuǎn)位。而Mu-CYLD組心肌纖維化水平與WT組無差異。
　　 結論:目前的研究表明，在壓力過負荷誘導的心肌肥大中，CYLD促進心臟擴張，惡化心功能，加速心臟由心肌肥大代償期向心力衰竭的轉(zhuǎn)換。其機制可能與CYLD促進心肌細胞凋亡，加重心肌纖維化相關，并且