RACK1對肝癌化療耐藥的調(diào)控及其相互作用蛋白CLEC-2的功能研究.pdf

1、第一部分:RACK1對肝癌細(xì)胞化療耐藥的調(diào)控及其機(jī)制研究
　　肝癌是目前全世界范圍內(nèi)最常見的并且具有高度致死性的腫瘤之一，在惡性腫瘤導(dǎo)致的死亡中居第三位。雖然常規(guī)的普查和監(jiān)護(hù)可以使得肝癌在早期可以得到診斷和治療，但由于肝癌細(xì)胞具有高度增殖的特性，絕大多數(shù)肝癌患者都是在進(jìn)展期甚至在晚期發(fā)現(xiàn)；而此時，多數(shù)腫瘤已不能被切除而患者必須接受姑息治療。化療作為一種常用的姑息療法，對于肝癌患者缺乏很好的效果。因為肝癌普遍對常用的化療藥物具有內(nèi)在

2、的抵抗性，全身性或者局部動脈內(nèi)給藥并不能達(dá)到抑制腫瘤生長和延長患者生存的效果。目前，肝癌細(xì)胞內(nèi)在化療耐藥的機(jī)制尚不清楚。
　　我們研究發(fā)現(xiàn)，構(gòu)架蛋白RACK1(receptor for activated C-kinase 1)在正常肝臟中高度表達(dá)，并且在肝癌患者中普遍表達(dá)增高。RACK1的表達(dá)增高可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞株對阿霉素的化療抵抗，而且這一過程是依賴于其核糖體定位的，因為非核糖體定位的RACK1的突變體甚至可以促進(jìn)阿霉素誘導(dǎo)的

3、肝癌細(xì)胞株的凋亡。進(jìn)一步研究表明，核糖體定位的RACK1可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞總體蛋白翻譯水平的增加，其機(jī)制可能是通過作用于真核細(xì)胞翻譯起始因子eIF4E來實現(xiàn)的。核糖體定位的RACK1可以與eIF4E相互作用，并且通過招募PKCβⅡ來促進(jìn)eIF4E的209位絲氨酸的磷酸化并增強eIF4E的活性。隨著eIF4E活性的增強，可以選擇性的促進(jìn)很多與細(xì)胞增殖和生存相關(guān)蛋白的翻譯，包括cyclin D1、c-myc、surviving和Bel-2。在

4、肝癌患者的標(biāo)本中，我們也發(fā)現(xiàn)RACK1的表達(dá)水平與cyclinD1、c-myc、surviving和Bcl-2的表達(dá)呈正相關(guān)。使用翻譯的抑制劑CHX，或者抑制eIF4E的表達(dá)或者其活性，則可以抑制野生型RACK1介導(dǎo)的化療抵抗。同時我們還發(fā)現(xiàn)，在化療藥物處理的情況下，過表達(dá)野生型RACK1可以介導(dǎo)應(yīng)激顆粒的形成，而過表達(dá)其非核糖體定位的突變體則沒有影響。抑制RACK1的表達(dá)或者過表達(dá)非核糖體定位的突變體可以抑制G3BP介導(dǎo)的應(yīng)激顆粒的形

5、成，提示RACK1及其核糖體定位與應(yīng)激顆粒的形成密切相關(guān)。另外，RACK1的表達(dá)增高可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞中AKT和ERK的活化，并引起肝癌細(xì)胞的增殖。綜上所述，我們第一次對RACK1在肝癌中的功能作了系統(tǒng)的研究，并為解釋肝癌細(xì)胞內(nèi)在的化療抵抗的特性奠定了一定的基礎(chǔ)。
　　第二部分:RACK1對C型凝集素樣受體CLEC-2表達(dá)調(diào)控的研究
　　CLEC-2是通過使用含有免疫學(xué)功能的C型凝集素結(jié)構(gòu)域篩選基因組數(shù)據(jù)庫時被鑒定的。人的CL

6、EC-2(hCLEC-2)是一個Ⅱ型跨膜的C型凝集素樣受體，并且可以被N-糖基化修飾。其中胞外段含有單個的C型凝集素樣結(jié)構(gòu)域和一個頸部區(qū)，胞漿尾部含有非經(jīng)典的免疫受體酪氨酸活化基序(D-x-Y-x-x-L)。最近研究表明，CLEC-2能夠識別外源性配體蛇毒Rhodocytin和內(nèi)源性配體Podoplanin，導(dǎo)致D-x-Y-x-x-L基序中的酪氨酸磷酸化，招募Syk酪氨酸激酶并激活血小板。另外，它還能夠協(xié)同DC-SIGN促進(jìn)血小板捕獲H

7、IV-1。鼠的CLEC-2(mCLEC-2)與hCLEC-2具有高度的同源性，我們研究發(fā)現(xiàn)mCLEC-2有兩個剪切異構(gòu)體，同時mCLEC-2的全長形式可以形成同源二聚體并且其胞外段可以被剪切成可溶性形式。mCLEC-2在中性粒細(xì)胞表面也有表達(dá)，并且發(fā)揮著介導(dǎo)內(nèi)化和活化中性粒細(xì)胞的功能。雖然目前對CLEC-2的功能已有一定的闡明，但是除Syk外與CLEC-2胞漿段相互作用的分子并沒有報道。
　　我們以hCLEC-2的胞漿段作為誘餌，

8、利用Ga14酵母雙雜交系統(tǒng)篩選人的白血病cDNA文庫。經(jīng)過三輪營養(yǎng)缺陷篩選，我們鑒定了構(gòu)架蛋白RACK1作為與hCLEC-2的一個相互作用蛋白。通過體外結(jié)合實驗我們證實了RACK1與hCLEC-2胞漿段之間直接的相互作用，體內(nèi)實驗中也通過免疫共沉淀證實了RACK1與hCLEC-2的相互作用，免疫熒光共聚焦分析也揭示了它們在細(xì)胞漿中存在共定位。進(jìn)一步實驗表明，RACK1可以通過降低hCLEC-2的蛋白穩(wěn)定性來抑制hCLEC-2的表達(dá)，包括

9、其未糖基化和糖基化兩種修飾形式。體內(nèi)泛素化實驗表明，RACK1可以通過增強hCLEC-2的泛素化來促進(jìn)其通過蛋白酶體途徑降解；使用蛋白酶體抑制劑MG132和lactacystin可以逆轉(zhuǎn)RACK1對hCLEC-2的表達(dá)抑制，而使用溶酶體抑制劑chloroquine則沒有影響。雖然RACK1可以抑制細(xì)胞內(nèi)總的糖基化CLEC-2的表達(dá)水平，但是卻不影響細(xì)胞表面CLEC-2的表達(dá)及其所介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)總酪氨酸的磷酸化。這也提示了RACK1可能參與

10、了糖蛋白CLEC-2的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)折疊和蛋白質(zhì)質(zhì)量控制的過程，也為研究內(nèi)源性CLEC-2的蛋白水平的調(diào)控奠定了基礎(chǔ)。
　　第三部分:CLEC-2識別CD74在B-CLL白血病細(xì)胞中的功能研究
　　人的CLEC-2(hCLEC-2)是一種Ⅱ型跨膜的C型凝集素樣受體，在肝臟、血小板、自然殺傷細(xì)胞和抗原提呈細(xì)胞中都有表達(dá)。然而，目前僅在血小板和巨核細(xì)胞表面檢測到其分布。人血小板表面的CLEC-2有32kD和40kD兩種修飾形式，其中32

11、kD占主要形式。最近研究表明，CLEC-2能夠識別外源性配體蛇毒Rhodocytin和內(nèi)源性配體Podoplanin，導(dǎo)致D-x-Y-x-x-L基序中的酪氨酸磷酸化，招募Syk酪氨酸激酶從而激活血小板。另外，它還能夠協(xié)同DC-SIGN促進(jìn)血小板捕獲HIV-1。
　　為了進(jìn)一步研究CLEC-2的生物學(xué)功能，我們以hCLEC-2的胞外段作為誘餌，利用Ga14酵母雙雜交系統(tǒng)篩選人的白血病cDNA文庫。經(jīng)過三輪營養(yǎng)缺陷篩選，我們鑒定了CD

12、74作為與hCLEC-2的一個相互作用蛋白。CD74又稱為MHCⅡ類分子恒定鏈，在抗原提呈過程中發(fā)揮著重要功能。近些年研究表達(dá)，部分CD74分子可以定位到細(xì)胞表面，作為一個受體分子發(fā)揮信號傳導(dǎo)功能。尤其是CD74在B淋巴細(xì)胞白血病(B-CLL)細(xì)胞表面高表達(dá)，可以促進(jìn)白血病細(xì)胞的增殖。我們表達(dá)并純化了CD74的胞外段與IgG1的Fc段的融合蛋白(Fc-CD74)，體外結(jié)合實驗證實Fc-CD74重組蛋白能夠選擇性地與40kD修飾形式的hC

13、LEC-2相互作用，而不能與32kD修飾形式的hCLEC-2結(jié)合。通過生物素標(biāo)記實驗證實了32kD和40kD兩種修飾的CLEC-2在細(xì)胞表面的分布，熒光共聚焦分析也揭示了Fc-CD74融合蛋白與hCLEC-2在細(xì)胞表面存在共定位。我們在CHO細(xì)胞中轉(zhuǎn)染了hCLEC-2的真核表達(dá)載體，并且將其與人B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株Raji共孵育。結(jié)果顯示，過表達(dá)hCLEC-2可以促進(jìn)CHO細(xì)胞與Raji細(xì)胞的粘附，同時也可以促進(jìn)Raji細(xì)胞中ERK信號的

14、活化；使用CD74的拮抗性抗體LN2則可以抑制CHO/hCLEC-2所介導(dǎo)的Raj-i細(xì)胞中ERK磷酸化的增強。細(xì)胞周期和CFSE標(biāo)記實驗表明，CHO/hCLEC-2細(xì)胞也以CD74依賴的方式促進(jìn)Raji細(xì)胞進(jìn)入S期和增殖。同樣，人巨核細(xì)胞株Dami也可以促進(jìn)Raji細(xì)胞的增殖，而這一過程可以被hCLEC-2或者CD74單克隆抗體抑制。這些數(shù)據(jù)揭示了40kD修飾的hCLEC-2可以識別CD74并促進(jìn)其下游信號傳導(dǎo)，并且提示了血小板可能通