人工關(guān)節(jié)硅酸二鈣涂層離子液對(duì)成骨細(xì)胞生物活性影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分硅酸二鈣涂層離子液對(duì)體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞早期增殖、細(xì)胞周期以及凋亡的影響 目的：探討硅酸二鈣涂層離子液對(duì)成骨細(xì)胞早期增殖及細(xì)胞周期、凋亡的影響及其機(jī)制。方法：將等離子噴涂的硅酸二鈣涂層鈦片于37℃浸泡在DMEM培養(yǎng)基中24小時(shí)，ICP測(cè)定培養(yǎng)基中Ca、P、Si離子濃度變化。含有硅酸二鈣涂層離子液的DMEM培養(yǎng)基作為實(shí)驗(yàn)組，正常DMEM培養(yǎng)基作為對(duì)照組，分別接種MG63細(xì)胞培養(yǎng)。MTT法及細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)定兩組MG63細(xì)胞6、12、

2、24、48、72小時(shí)細(xì)胞增殖情況；流式細(xì)胞儀測(cè)定MG63細(xì)胞12、24、48、72小時(shí)G0/G1、S、G2/M期細(xì)胞數(shù)量變化、增殖活性指標(biāo)(PI)和細(xì)胞凋亡率；結(jié)果：在硅酸二鈣涂層浸泡24小時(shí)后，培養(yǎng)基中Si離子濃度顯著增加約17倍，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而ca、P離子濃度略有降低，但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與正常培養(yǎng)基中比較，在硅酸二鈣涂層條件培養(yǎng)基中，MG63細(xì)胞增殖在各時(shí)間點(diǎn)明顯增強(qiáng)，在24和72小時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，在12、24

3、小時(shí)，兩組中處在各期細(xì)胞數(shù)量沒(méi)有明顯差別，在48、72小時(shí)，實(shí)驗(yàn)組G0/G1期MG63細(xì)胞明顯降低；在72小時(shí)，實(shí)驗(yàn)組S期細(xì)胞較對(duì)照組增多2倍；實(shí)驗(yàn)組G2/M期細(xì)胞在48小時(shí)顯著增多。在12、24小時(shí)，兩組細(xì)胞的凋亡率都較低，未見(jiàn)明顯差別，在48小時(shí)和72小時(shí)，實(shí)驗(yàn)組MG63細(xì)胞凋亡率顯著高于對(duì)照組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論：硅酸二鈣涂層離子液能夠促進(jìn)MG63細(xì)胞早期增殖，而這種作用是通過(guò)加速成骨細(xì)胞周期達(dá)到的。 第二部分硅酸二鈣涂層

4、離子液對(duì)體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞早期分化及成骨細(xì)胞特異性基因表達(dá)的影響 目的：通過(guò)測(cè)定成骨細(xì)胞分化及成骨細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá)，探討硅酸二鈣涂層離子液對(duì)體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞分化及成骨特異性基因表達(dá)的影響及其可能機(jī)制。方法：含有硅酸二鈣離子溶出液的DMEM培養(yǎng)基作為實(shí)驗(yàn)組，正常DMEM培養(yǎng)基作為對(duì)照組，分別接種人MG63成骨細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。分別于6、12、24、48、72小時(shí)采用生化法測(cè)定培養(yǎng)液中堿性磷酸酶(ALP)活性，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)堿性

5、磷酸酶(ALP)、骨鈣素(OC)、I型膠原(COL-1)、成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子(Cbfal)基因表達(dá)變化，并進(jìn)行比較。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組MG63細(xì)胞ALP活性在各時(shí)間點(diǎn)都增強(qiáng)，與對(duì)照組相比在6h，48h和72h有顯著性差異。Real time PCR檢測(cè)顯示，MG63細(xì)胞Cbfa1轉(zhuǎn)錄水平在所有時(shí)間點(diǎn)均較對(duì)照組上調(diào)，在6h，12h和24h有顯著性差異；ALP轉(zhuǎn)錄水平在12h和24h較對(duì)照組顯著上調(diào)，然后在48h和72h降低到對(duì)照組水平以下，

6、但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；I型膠原轉(zhuǎn)錄水平在各時(shí)間點(diǎn)均較對(duì)照組高，在24h有顯著性差異；OC轉(zhuǎn)錄在兩組早期均未檢測(cè)到。結(jié)論：硅酸二鈣涂層離子液能夠在早期上調(diào)成骨細(xì)胞特異性基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化，加速骨的形成；硅酸二鈣涂層離子液在早期增強(qiáng)成骨細(xì)胞的凋亡，這與成骨細(xì)胞分化增強(qiáng)有關(guān)。 第三部分硅酸二鈣涂層離子液對(duì)體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞破骨細(xì)胞分化相關(guān)基因表達(dá)及其蛋白分泌的影響 目的：通過(guò)測(cè)定破骨細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá)及其蛋白分泌

7、，探討硅酸二鈣涂層離子液對(duì)破骨細(xì)胞分化的影響及可能機(jī)制。方法：含有硅酸二鈣離子溶出液的DMEM培養(yǎng)基作為實(shí)驗(yàn)組，正常DMEM培養(yǎng)基作為對(duì)照組，分別接種人MG63成骨細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。分別于6、12、24、48、72小時(shí)采用實(shí)時(shí)定量PCR(Real time PCR)檢測(cè)OPG、RANKL、TNF-α基因表達(dá)變化，ELISA方法檢測(cè)OPG、RANKL、TNF-α蛋白分泌量，并進(jìn)行比較。結(jié)果：Real time PCR檢測(cè)顯示，實(shí)驗(yàn)組MG63細(xì)

8、胞OPG轉(zhuǎn)錄水平在各時(shí)間點(diǎn)都增強(qiáng)并在72小時(shí)達(dá)到高峰，與對(duì)照組相比在6h，12，24和48h有顯著性差異。MG63細(xì)胞RANKL，轉(zhuǎn)錄水平在6，12h和24h非常低，在48h和72h顯著增高，但實(shí)驗(yàn)組RANKL轉(zhuǎn)錄水平明顯低于對(duì)照組，有顯著性差異；TNF-α的轉(zhuǎn)錄在兩組中均未檢測(cè)到；實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基中OPG蛋白分泌量在各時(shí)間點(diǎn)均高于對(duì)照組，在48h和72h有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；實(shí)驗(yàn)組RANKL蛋白分泌量在各時(shí)間點(diǎn)都低于對(duì)照組，但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。TN

9、F-α蛋白分泌在各時(shí)間點(diǎn)均低于對(duì)照組，并在72小時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論：硅酸二鈣涂層離子液能夠在早期上調(diào)OPG基因的表達(dá)，下調(diào)RANKL基因表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)OPG蛋白分泌，抑制TNF-α分泌，通過(guò)調(diào)節(jié)OPG/RANKL比率抑制破骨細(xì)胞的分化和活性，減少骨吸收，加速骨的形成。 第四部分硅酸二鈣涂層離子液對(duì)體外培養(yǎng)高齡來(lái)源人成骨細(xì)胞增殖、分化及對(duì)TGF-β1分泌的影響 目的：探討硅酸二鈣涂層離子液對(duì)高齡來(lái)源的成骨細(xì)胞增殖、分化及

10、TGF-β1分泌的影響及其機(jī)制。方法：采用原代培養(yǎng)技術(shù)從高齡患者(大于60歲)廢棄骨組織分離培養(yǎng)出成骨細(xì)胞并鑒定。將等離子噴涂的硅酸二鈣涂層鈦片于37℃浸泡在DMEM培養(yǎng)基中72小時(shí)，ICP測(cè)定培養(yǎng)基中Ca、P、Si離子濃度變化。含有硅酸二鈣涂層離子液的DMEM培養(yǎng)基作為實(shí)驗(yàn)組，正常DMEM培養(yǎng)基作為對(duì)照組，分別接種高齡來(lái)源成骨細(xì)胞培養(yǎng)。分別于1、3、7、14天采用MTT法測(cè)定兩組成骨細(xì)胞細(xì)胞增殖情況；采用生化法檢測(cè)ALP活性；ELIS

11、A方法檢測(cè)TGF-β1蛋白分泌量；并進(jìn)行比較。結(jié)果：與正常培養(yǎng)基中比較，條件培養(yǎng)基中硅離子濃度增加了19倍，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而鈣和磷離子的濃度降低，但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在硅酸二鈣涂層條件培養(yǎng)基中，高齡來(lái)源成骨細(xì)胞增殖在各時(shí)間點(diǎn)明顯增強(qiáng)，在第3天有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。實(shí)驗(yàn)組成骨細(xì)胞ALP活性始終高于對(duì)照組，并在第7天有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；EIASA結(jié)果顯示在第1天和第3天，試驗(yàn)組中TGF-β1含量較對(duì)照組顯著增高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而在第7天，試驗(yàn)組TGF-β1

12、含量顯著下降并低于對(duì)照組，但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，在第14天，兩組中TGF-β1含量沒(méi)有明顯差異。結(jié)論：硅酸二鈣涂層的離子溶出液能夠促進(jìn)高齡來(lái)源成骨細(xì)胞增殖和分化，而這種作用是通過(guò)促進(jìn)TGF-β1分泌達(dá)到的。 第五部分硅酸二鈣涂層離子液對(duì)體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞TGF-β1分泌及其受體基因表達(dá)的影響及其機(jī)制 目的：探討硅酸二鈣涂層離子液對(duì)成骨細(xì)胞增殖、分化及TGF-β1分泌及其受體基因表達(dá)的影響及其機(jī)制。方法：含有硅酸二鈣涂層離子液的

13、DMEM培養(yǎng)基作為實(shí)驗(yàn)組，正常DMEM培養(yǎng)基作為對(duì)照組，分別接種MG63成骨細(xì)胞培養(yǎng)1、3、7、14天，成骨細(xì)胞分化通過(guò)ALP活性及骨鈣素(OC)及其基因的表達(dá)檢測(cè)；ELISA方法檢測(cè)OC，TGF-β1蛋白分泌量；采用實(shí)時(shí)定量PCR(Real time PCR)檢測(cè)TGF-β1 I型受體和II型受體基因表達(dá)變化，并進(jìn)行比較。結(jié)果：在硅酸二鈣條件培養(yǎng)基中，硅酸二鈣離子溶出液能夠促進(jìn)MG63細(xì)胞ALP活性及OC的分泌而促進(jìn)細(xì)胞的分化，ELI

14、SA結(jié)果顯示在條件培養(yǎng)基中TGF-β1分泌較正常培養(yǎng)基中有所增強(qiáng)，同時(shí)TGF-β受體基因表達(dá)也同樣增高，與正常培養(yǎng)基中比較，在硅酸二鈣涂層條件培養(yǎng)基中，MG63細(xì)胞ALP活性從第3天開(kāi)始增強(qiáng)并高于對(duì)照組，并在第7天和14天有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。骨鈣素OC的分泌在14天明顯高于在正常培養(yǎng)基中，并有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，二者的基因表達(dá)也表現(xiàn)為相同的趨勢(shì)；ELISA結(jié)果顯示在第1天和第3天，試驗(yàn)組中TGF-β1含量較對(duì)照組顯著增高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而在第7天，試