水通道蛋白4在腦出血損傷及水腫中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、第一部分AQP4與腦出血水腫形成的關(guān)系研究
　　目的:腦出血(intracerebralhemorrhage,ICH)的發(fā)病率占卒中的10％-15％,并伴隨著較高的致死和致殘率。水通道蛋白-4(AQP4)是一類(lèi)廣泛分布于毛細(xì)血管周?chē)切湍z質(zhì)細(xì)胞足突的跨膜水通道蛋白,然而至今對(duì)AQP4的功能及其在腦出血后水腫的形成中所起到的作用尚知之甚少。該研究的目的是以AQP4-/-小鼠為基礎(chǔ),研究AQP4在腦出血后水腫形成中的作用。
　　

2、方法:分別在AQP4+/+和AQP4-/-兩組小鼠右側(cè)基底節(jié)區(qū)立體定向注入5μl自體全血建立腦出血模型。比較兩組小鼠腦出血后神經(jīng)功能缺損、腦含水量、血腫周?chē)M織腦比重、伊文氏蘭漏出量及腦組織毛細(xì)血管超微結(jié)構(gòu)間的差異。
　　結(jié)果:研究發(fā)現(xiàn)腦出血后AQP4+/+小鼠腦內(nèi)AQP4蛋白表達(dá)量顯著增高。AQP4基因的缺失加劇了腦出血神經(jīng)功能缺損及患側(cè)大腦半球含水量。同時(shí),AQP4的缺失降低了血腫周?chē)M織的腦比重。此外,AQP4基因缺失加劇了

3、伊文氏蘭的滲漏及毛細(xì)血管超微結(jié)構(gòu)的損壞。
　　結(jié)論:上述結(jié)果提示AQP4基因缺失加劇了腦出血損傷,包括水腫形成、血腦屏障(BBB)破壞。對(duì)腦出血后AQP4表達(dá)增高的保護(hù)性機(jī)制研究可能會(huì)為臨床治療腦出血后腦水腫提供新的靶點(diǎn)及思路。
　　第二部分腦出血AQP4高表達(dá)與神經(jīng)細(xì)胞死亡/調(diào)亡的關(guān)系
　　目的:膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)數(shù)量眾多的一大類(lèi)細(xì)胞群體,約占CNS細(xì)胞總數(shù)的90％,星形膠質(zhì)細(xì)胞是其中主要的組成成分。AQP4在腦內(nèi)

4、星型膠質(zhì)細(xì)胞上特異性表達(dá)。AQP4廣泛的參與星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能,是否在腦出血時(shí)也會(huì)影響到細(xì)胞死亡和凋亡呢?該部分研究的目的是以AQP4-/-小鼠為基礎(chǔ),研究AQP4與神經(jīng)細(xì)胞死亡/調(diào)亡的關(guān)系。
　　方法:分別在AQP4+/+和AQP4-/-兩組小鼠右側(cè)基底節(jié)區(qū)立體定向注入5μl自體全血建立腦出血模型。首先用尼氏染色,TUNEL染色和Hochest染色比較兩組小鼠神經(jīng)細(xì)胞死亡率和凋亡率的差異性,然后利用Westernblot和免疫組

5、化技術(shù)測(cè)定Caspase3,Caspase8,Caspase9,Bax,Bcl2共5種凋亡蛋白的差異性;進(jìn)一步使用細(xì)胞因子抗體芯片比較AQP4+/+和AQP4-/-兩組小鼠腦出血后腦內(nèi)細(xì)胞因子表達(dá)差異性,然后再用Elisa驗(yàn)證抗體芯片結(jié)果;腦室內(nèi)注入IL-1ra,TNFbp,LNMMA和PTIO,然后觀察腦出血小鼠神經(jīng)細(xì)胞死亡和凋亡變化;最后觀察腦出血后AQP4+/+和AQP4-/-兩組小鼠腦內(nèi)IL-1β受體和TNFα受體的表達(dá)改變,并

6、利用培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞,分別與IL-1β,TNFα,SNP,LPS共培養(yǎng),觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞死亡/凋亡率改變情況。
　　結(jié)果:研究結(jié)果提示:尼氏及Hochest染色,TUNEL染色顯示AQP4缺失加劇了腦出血后神經(jīng)細(xì)胞的損傷及血腫周?chē)?xì)胞的凋亡。Westernblot和免疫組化實(shí)驗(yàn)表明,腦出血后,與野生型小鼠相比,AQP4基因敲除小鼠腦內(nèi)的促凋亡蛋白Caspase3,Caspase8,Caspase9,Bax表達(dá)增高,抑凋亡蛋白Bc

7、l2下降;細(xì)胞因子抗體芯片和Elisa結(jié)果提示:腦出血后,與野生型小鼠相比,AQP4基因敲除小鼠腦內(nèi)的IL-1β,IL-6,IL-12,TNFα,以及N0均出現(xiàn)了明顯的增高;而這種過(guò)表達(dá)的細(xì)胞因子是造成腦出血細(xì)胞死亡和凋亡的原因之一。AQP4基因缺失沒(méi)有改變腦出血小鼠腦內(nèi)IL-1β受體和TNFα受體的表達(dá),也沒(méi)有使星形膠質(zhì)細(xì)胞在面對(duì)有害細(xì)胞因子時(shí)更容易發(fā)生死亡/凋亡。
　　結(jié)論:上述結(jié)果提示AQP4基因缺失加劇了腦出血損傷,包括神