水孔蛋白-4在腦出血后腦水腫形成中的作用及其調(diào)節(jié)機(jī)制的研究.pdf

1、第一部分 腦出血大鼠血腫周圍組織水孔蛋白-4的表達(dá)分析 目的：研究腦出血(intracerebrahemorrhage，ICH)后血腫周圍組織水孔蛋白-4(aquaporin-4,AQP4)表達(dá)的變化，探討AQP4在腦水腫形成過程中的作用。 方法：運(yùn)用立體定向技術(shù)，向大鼠尾殼核內(nèi)注射自體尾動脈血建立腦出血模型。采用免疫組織化學(xué)技術(shù)對出血周圍組織及皮質(zhì)AQP4蛋白進(jìn)行動態(tài)檢測。 結(jié)果：與正常組比較，腦出血6

2、h后血腫周圍組織AQP4蛋白表達(dá)開始增高(P＜0.01)，在出血第3天達(dá)高峰(P＜0.01)，以后逐漸下降，到第7天仍高于正常水平(P＜0.01)，與腦出血后腦水腫的變化規(guī)律相似。在大腦皮質(zhì)AQP4蛋白表達(dá)亦相應(yīng)增加，但不如血腫周圍組織明顯。單純尾殼核內(nèi)注射凝血酶后，注射部位鄰近腦組織AQP4蛋白表達(dá)增高主要集中在注射后第1～3天。 結(jié)論：腦出血時血腫周圍AQP4蛋白表達(dá)增加，與水腫進(jìn)程關(guān)系密切。AQP4蛋白表達(dá)可能主要由凝血酶

3、所誘導(dǎo)，上調(diào)的AQP4蛋白可能參與腦出血后腦水腫的形成。 第二部分 凝血酶對大鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞水孔蛋白-4表達(dá)的影響 目的：研究不同濃度凝血酶(thrombin，TB)對體外培養(yǎng)大鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞水孔蛋白-4(aquaporin-4,AQP4)表達(dá)的影響，探討腦出血后星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫機(jī)制。 方法：新生SD大鼠大腦皮質(zhì)分離星形膠質(zhì)細(xì)胞，傳代培養(yǎng)純化至98％以上。分別用0.5U/ml，1U/ml，100U

4、/ml，200U/ml濃度的凝血酶對星形膠質(zhì)細(xì)胞處理24h后，采用RT-PCR及免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP4mRNA和AQP4蛋白表達(dá)，TUNEL方法檢測細(xì)胞凋亡情況，并對星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)及細(xì)胞活性觀察。 結(jié)果：正常星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP4mRNA和AQP4蛋白呈微弱表達(dá)，高濃度的凝血酶(100U/ml，200U/ml)處理后，AQP4mRNA和AQP4蛋白表達(dá)明顯升高(P＜0.01)，星形膠質(zhì)細(xì)胞腫脹，TUNEL

5、陽性細(xì)胞數(shù)顯著增多。低濃度的凝血酶(0.5U/ml，1U/ml)處理后，AQP4mRNA和AQP4蛋白表達(dá)出現(xiàn)下調(diào)(P＜0.05)，星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)無明顯變化，細(xì)胞凋亡數(shù)與對照組比較并沒有顯著增加。 結(jié)論：高濃度凝血酶能誘導(dǎo)AQP4mRNA及AQP4蛋白高表達(dá)，使星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體腫脹，細(xì)胞活性下降，并發(fā)生凋亡。 第三部分 水孔蛋白-4與血腦屏障通透性關(guān)系及其調(diào)節(jié)的實驗研究 目的：探討精氨酸加壓素及V1a受

6、體(V1aR)拮抗劑對腦出血后水孔蛋白-4(aquaporin-4，AQP4)表達(dá)及血腦屏障(blood-brainbarrier，BBB)通透性的影響。 方法：運(yùn)用立體定向技術(shù)，向大鼠尾殼核內(nèi)注射自體尾動脈血建立腦出血模型。模型制作成功后，治療組側(cè)腦室注射V1aR拮抗劑，ICH組僅注射等量人工腦脊液。采用免疫組織化學(xué)技術(shù)對血腫周圍組織AQP4蛋白進(jìn)行檢測。通過檢測滲出到腦血管外的伊文氏藍(lán)(EvansBlue,EB)的含量來定量

7、觀察BBB的通透性。 結(jié)果：腦出血6h后尾殼核血腫周圍組織AQP4蛋白表達(dá)開始增高，在腦出血第1天達(dá)高峰(P＜0.01)，持續(xù)到第3天以后逐漸下降，到第7天仍高于正常水平。而用V1aR拮抗劑腦室注射后，AQP4蛋白表達(dá)在各時間點表達(dá)明顯降低。BBB通透性在腦出血6h后開始升高，1d達(dá)高峰(P＜0.01)，3d后回落，AQP4蛋白表達(dá)與BBB通透性呈顯著正相關(guān)。側(cè)腦室注入V1aR拮抗劑后，BBB通透性與對照組比較明顯下降(P＜0.

8、05)。 結(jié)論：腦出血時AQP4表達(dá)增加參與了BBB的破壞，V1aR拮抗劑能抑制AQP4蛋白的表達(dá)，保護(hù)BBB，減輕腦出血后腦水腫。 第四部分 精氨酸加壓素對原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞水孔蛋白-4表達(dá)的影響 目的：研究精氨酸加壓素(argininevasopressin，AVP)對體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞水孔蛋白-4(aquaporin-4，AQP4)表達(dá)的影響，探討精氨酸加壓素對星形膠質(zhì)細(xì)胞容積調(diào)節(jié)的機(jī)制。

9、 方法：新生SD大鼠大腦皮質(zhì)分離星形膠質(zhì)細(xì)胞，傳代培養(yǎng)純化至98％以上。星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)500nM的AVP及其與V1a受體(V1aR)拮抗劑共同處理1、6、12、24h后，采用免疫組織化學(xué)技術(shù)及RT-PCR對AQP4蛋白和AQP4mRNA進(jìn)行檢測，并對星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。并對腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，AVP處理后倒置顯微鏡下動態(tài)觀察形態(tài)變化。 結(jié)果：500nM的AVP處理6h后，AQP4mRNA表達(dá)開始升高(P＜0.01

10、)，到12h達(dá)高峰(P＜0.01)，24h后仍維持在較高的水平(P＜0.05)。AVP處理后AQP4蛋白表達(dá)亦出現(xiàn)相似的變化。V1aR拮抗劑干預(yù)后，AQP4蛋白及AQP4mRNA表達(dá)與對照組比較未出現(xiàn)升高(P＞0.05)。此外，AVP干預(yù)24h后星形膠質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)胞體腫脹，突起回縮，加用V1aR拮抗劑處理后該現(xiàn)象未出現(xiàn)。AVP干預(yù)對腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)沒有影響。 結(jié)論：高水平的AVP能通過激活V1aR而誘導(dǎo)AQP4mRNA和AQP

11、4蛋白高表達(dá)，導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體腫脹，突起回宿，失去正常星形形態(tài)。AVP對AQP4表達(dá)有調(diào)控作用，借此可對星形膠質(zhì)細(xì)胞體積進(jìn)行調(diào)節(jié)，但對腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞無此作用。 第五部分 精氨酸加壓素誘導(dǎo)水孔蛋白-4表達(dá)及細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究 目的：探討在精氨酸加壓素(argininevasopressin，AVP)在上調(diào)AQP4(aquaporin-4，AQP4)表達(dá)過程中，p38MAPK信號通路的作用及對星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的

12、作用。 方法：大鼠大腦皮質(zhì)分離星形膠質(zhì)細(xì)胞，傳代培養(yǎng)純化至98％以上。星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)分別用AVP、V1a受體(V1aR)拮抗劑和SB203580進(jìn)行處理，采用免疫組織化學(xué)技術(shù)及RT-PCR對AQP4mRNA進(jìn)行檢測，Westernblot檢測p38MAPK信號通路在AVP誘導(dǎo)AQP4表達(dá)中的活化程度，及Caspase-3P20活性片段。同時對星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)和細(xì)胞活性觀察。 結(jié)果：500nM的AVP處理6h后，AQ

13、P4mRNA表達(dá)開始升高(P＜0.01)，到12h達(dá)高峰(P＜0.01)，24h后仍維持在較高的水平(P＜0.05)。加入p38MAPK抑制劑SB203580干預(yù)后，AQP4mRNA表達(dá)水平與對照組比較差異不顯著(P＞0.05)；AVP處理15min后p38MAPK磷酸化水平開始增加，30min達(dá)高峰，持續(xù)到60min開始下降。V1aR拮抗劑處理后p38MAPK磷酸化水平整個時間段均未出現(xiàn)明顯變化；AVP作用后6hCaspase-3蛋白

14、表達(dá)開始增加(P＜0.01)，12h時表達(dá)達(dá)高峰(P＜0.01)，到24h仍高于正常水平。此外，AVP干預(yù)后細(xì)胞活性下降，凋亡細(xì)胞增多，SB203580及V1aR拮抗劑對AVP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡均有抑制作用。 結(jié)論：AVP通過激活V1aR引起p38MAPK信號通路活化從而誘導(dǎo)AQP4mRNA高表達(dá)，從基因水平對AQP4進(jìn)行調(diào)節(jié)，并增加Caspase-3活性，使星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生凋亡。p38MAPK抑制劑及V1aR拮抗劑抑制AQP4mR