VEGI調(diào)節(jié)顱腦創(chuàng)傷后腦水腫的實(shí)驗(yàn)研究.pdf_第1頁(yè)
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文檔簡(jiǎn)介

1、研究目的:
  1、通過(guò)觀察VEGI(Vascular Endothelial Growth Inhibitor)在創(chuàng)傷性腦損傷(Traumatic Brain Injury,TBI)后小鼠的血腦屏障調(diào)控作用,腦水腫抑制作用,以及神經(jīng)功能的恢復(fù)改善情況,明確其在腦創(chuàng)傷的功能作用,并初步探討其潛在作用機(jī)制。
  2、通過(guò)觀察VEGI在VEGF-A(Vascular Endothelial Growth Factor A)所誘導(dǎo)

2、的體外血腦屏障(Blood Brain Barrier,BBB)模型滲漏的抑制作用,上調(diào)緊密連接蛋白作用,并在形態(tài)學(xué)上進(jìn)行確認(rèn),明確VEGI能夠抑制VEGFR2受體的磷酸化從而抑制VEGF-A所造成的BBB滲漏,并初步探討其在細(xì)胞水平的作用機(jī)制。
  研究方法:
  1、體內(nèi)試驗(yàn)部分:本實(shí)驗(yàn)選用清潔級(jí)健康成年C57B1/6小鼠,隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組1(空白對(duì)照組)、實(shí)驗(yàn)組2(假手術(shù)組)、實(shí)驗(yàn)組3(單純TBI組)和實(shí)驗(yàn)組4(TBI+

3、VEGI組)。分組后,我們建立小鼠液壓打擊顱腦創(chuàng)傷模型,應(yīng)用小鼠神經(jīng)功能評(píng)分和Morris水迷宮評(píng)價(jià)其行為學(xué)功能,并應(yīng)用尹文思藍(lán)、免疫熒光技術(shù)對(duì)小鼠血腦屏障的滲漏、緊密連接蛋白、血管標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)。
  2、體外實(shí)驗(yàn)部分:本實(shí)驗(yàn)利用C57小鼠的鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞bEnd.3構(gòu)建體外血腦屏障模型,隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組1(空白對(duì)照組)、實(shí)驗(yàn)組2(VEGI組)、實(shí)驗(yàn)組3(VEGF-A組)和實(shí)驗(yàn)組4(VEGF-A+VEGI組)。分組后,我們利用所

4、構(gòu)建的血腦屏障模型,測(cè)量細(xì)胞的跨膜電阻值檢測(cè)血腦屏障滲漏的程度,并利用免疫熒光技術(shù)、Western Blot技術(shù)測(cè)定緊密連接蛋白的表達(dá)程度,并利用跳躍探針式離子電導(dǎo)顯微鏡(Hopping Probe Ion Conductance Microscopy,HPICM)連續(xù)實(shí)時(shí)觀測(cè)緊密連接的納米級(jí)形態(tài)學(xué)變化。
  研究結(jié)果:
  1、體內(nèi)試驗(yàn)部分:液壓打擊后,實(shí)驗(yàn)組3和實(shí)驗(yàn)組4的小鼠在遭受液壓打擊后,mNSS評(píng)分立即升高,在傷后

5、12小時(shí),兩組間評(píng)分無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但隨著傷情的逐漸恢復(fù),差異漸漸呈現(xiàn)。在傷后24小時(shí),遭受創(chuàng)傷的實(shí)驗(yàn)組3小鼠評(píng)分高于實(shí)驗(yàn)組4(P<0.01),這種差異在受傷后的第7天消失。Morris水迷宮定位航行測(cè)試中,實(shí)驗(yàn)組3和實(shí)驗(yàn)組4中,TBI組的小鼠于第三天開(kāi)始,與假手術(shù)組相比較出現(xiàn)了統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,這種差異一直保持至第五天訓(xùn)練結(jié)束;Morris水迷宮空間探索測(cè)試中,實(shí)驗(yàn)組3和實(shí)驗(yàn)組4與實(shí)驗(yàn)組1和實(shí)驗(yàn)組2相比較之間存在著明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,其目標(biāo)象限

6、百分比均明顯下降(P<0.01),實(shí)驗(yàn)組3和實(shí)驗(yàn)組4相比較也出現(xiàn)明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)組3相比較實(shí)驗(yàn)組4的EB滲漏率明顯更低(P<0.01)。免疫熒光也顯示實(shí)驗(yàn)組3與實(shí)驗(yàn)組4之間,CLN5、Alb的表達(dá)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。
  2、體外實(shí)驗(yàn)部分:體外培養(yǎng)的bEnd.3細(xì)胞得TEER(Ω·cm2)的所測(cè)值中,對(duì)照組、VEGI預(yù)處理組以及VEGI+VEGF組之間未見(jiàn)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,而VEGF組相對(duì)于對(duì)照組明

7、顯下降(P<0.01)。在HPICM連續(xù)24h觀測(cè)中,空白對(duì)照組、VEGI預(yù)處理組、VEGI+VEGF組的bEnd.3細(xì)胞形態(tài)以及細(xì)胞間緊密連接基本未發(fā)生明顯的形態(tài)學(xué)變化,然而VEGF組卻在加入100ng/ml VEGF-A之后16h逐漸出現(xiàn)了緊密連接高度的降低,并隨時(shí)間的推移這種高度的降低更加明顯;并且,這種變化還體現(xiàn)在相對(duì)粗糙度的變化上(P<0.01)。免疫熒光檢測(cè)中發(fā)現(xiàn):VEGF-A可明顯降低Claudin-5的表達(dá)(P<0.01

8、),但這種抑制作用可被VEGI所抑制。在Western Blot檢測(cè)中,可見(jiàn),100ng/ml VEGF-A可明顯降低Claudin-5、Occlaudin的表達(dá)(P<0.01),但未對(duì)ZO-1的表達(dá)造成任何統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異。并且,相對(duì)于VEGF-A組,VEGI+VEGF-A組可明顯抑制VEGF-A對(duì)Claudin-5、Occlaudin的下調(diào)作用;VEGFR2上的pY1175位點(diǎn)的磷酸化可被VEGF-A激活,但VEGI對(duì)這種VEGF-A

9、誘導(dǎo)的磷酸化具有抑制作用。
  研究結(jié)論:
  1、在體實(shí)驗(yàn):VEGI可以抑制TBI后小鼠的繼發(fā)性腦水腫、減輕血腦屏障的滲漏、上調(diào)緊密連接蛋白,發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用,從而改善小鼠腦神經(jīng)功能及行為學(xué)指標(biāo),為開(kāi)發(fā)VEGI治療TBI后腦水腫提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
  2、體外實(shí)驗(yàn):VEGI可以抑制VEGF-A所誘導(dǎo)的BBB體外模型的滲漏、上調(diào)緊密連接蛋白,我們首次利用HPICM觀測(cè)到了bEND.3在VEGI/VEGF-A的作用下所表現(xiàn)

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