白藜蘆醇保護(hù)神經(jīng)干細(xì)胞氧糖剝奪損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、實(shí)驗(yàn)一、化學(xué)自調(diào)控缺氧盒的設(shè)計(jì)及應(yīng)用
　　【研究背景】近年來(lái),缺血性腦卒中發(fā)病率成明顯的上升趨勢(shì),因此對(duì)缺血性腦卒中進(jìn)行有效的防治具有及為重要的意義。明確其細(xì)胞分子機(jī)制是研究防治缺血性腦損傷的關(guān)鍵。細(xì)胞體外培養(yǎng)氧糖剝奪模型是目前最常用的模擬機(jī)體缺血、缺氧的實(shí)驗(yàn)方法,缺氧條件的構(gòu)建是細(xì)胞氧糖剝奪實(shí)驗(yàn)的先決因素。目前,常用的缺氧細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備是無(wú)氧孵箱,其主要的工作原理是通過(guò)無(wú)氧混合氣體替換出孵箱中的空氣來(lái)實(shí)現(xiàn)缺氧。然而,無(wú)氧孵箱的體積

2、大,無(wú)氧氣體替換空氣的效率較低,并需要持續(xù)通入無(wú)氧氣體才能維持缺氧狀態(tài)。設(shè)計(jì)一種簡(jiǎn)單、便攜、易操作并且能自動(dòng)地維持缺氧狀態(tài)的缺氧盒成為迫切需求。
　　焦性沒(méi)食子酸水溶液在常溫條件下相對(duì)穩(wěn)定,而其堿性溶液能夠快速地與空氣中的氧發(fā)生反應(yīng),這一特點(diǎn)明顯有別于其他氧氣清除劑。因此,用焦性沒(méi)食子酸與氫氧化鈉構(gòu)成的堿性溶液作為氧氣清除劑,是一較為理想的選擇。
　　細(xì)胞培養(yǎng)需要穩(wěn)定的酸堿環(huán)境,Na2HPO4/NaH2PO4和NaHCO3/

3、H2CO3是常見(jiàn)的水溶液緩沖對(duì),緩沖液能夠維持其溶液穩(wěn)定的PH值環(huán)境,穩(wěn)定的二氧化碳濃度與溶液中NaHCO3能夠維持一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的PH值。
　　我們應(yīng)用這些物理和化學(xué)特點(diǎn)設(shè)計(jì)了一種簡(jiǎn)易的化學(xué)自動(dòng)調(diào)控缺氧盒,該缺氧盒既能滿足缺氧、也能滿足二氧化碳濃度的要求。
　　【目的】設(shè)計(jì)一種化學(xué)自調(diào)控缺氧細(xì)胞培養(yǎng)盒,并探討其可行性和實(shí)驗(yàn)使用方法。
　　【方法】將1.5L密封盒改裝成缺氧盒。將11.5g氫氧化鈉和2.6g碳酸鈉溶于55

4、ml水中,18g焦性沒(méi)食子酸溶于100ml水中,先后注入到密封真空輸液袋內(nèi),配成焦性沒(méi)食子酸堿性溶液,并將焦性沒(méi)食子酸堿性溶液輸注到缺氧盒內(nèi),要求加注時(shí)間不超過(guò)2min,用來(lái)快速地清除培養(yǎng)盒內(nèi)的氧氣。30min后再將47.8g二水磷酸二氫鈉溶于110ml水中,并注入到缺氧盒內(nèi)。NaH2PO4與氫氧化鈉、碳酸鈉化學(xué)反應(yīng)用部分生成Na2HPO4,Na2HPO4/NaH2PO4構(gòu)成基礎(chǔ)緩沖對(duì),維持化學(xué)反應(yīng)液的PH值。碳酸鈉之后部分生成NaHC

5、O3和H2CO3,并進(jìn)一步通過(guò)NaHCO3/H2CO3緩沖對(duì)維持缺氧盒內(nèi)二氧化碳濃度,在化學(xué)反應(yīng)液中Na2HPO4/NaH2PO4的量遠(yuǎn)大于NaHCO3/H2CO3。因此,二氧化碳的釋放對(duì)化學(xué)反應(yīng)液的pH值影響較小。用測(cè)氧儀檢測(cè)盒內(nèi)氧氣濃度,并以二氧化碳測(cè)量?jī)x檢測(cè)二氧化碳的濃度,應(yīng)用pH儀測(cè)化學(xué)反應(yīng)液的pH值,再用血?dú)夥治鰞x檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基的pH值。以U87、U251和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞,對(duì)照組將盒內(nèi)持續(xù)通入95％N2+5%CO2

6、混合氣體使氧濃度低于0.2%,CCK-8測(cè)量缺氧盒組與95%N2+5%CO2組細(xì)胞活性進(jìn)行比較。每一組實(shí)驗(yàn)指標(biāo)均重復(fù)5次。
　　【結(jié)果】將18g焦性沒(méi)食子酸、11.5g氫氧化鈉和2.6g碳酸鈉配成的堿性吸氧液注入到缺氧盒內(nèi)并計(jì)時(shí),測(cè)量盒內(nèi)氧氣的體積濃度,在5min時(shí)氧濃度為0.592%±0.0798%,10min為0.238%±0.0278%,15min為0.200%±0.02236%,30min為0.194%±0.01342%,

7、24h為0.194%±0.0321%。氧濃度在10min后趨于穩(wěn)定,10min、15min、30min、24h相互比較無(wú)明顯差異(P>0.05)。30min時(shí)將磷酸二氫鈉溶液注入到盒內(nèi),24h時(shí)測(cè)量盒內(nèi)二氧化碳濃度為5.03%±0.19%,化學(xué)反應(yīng)液pH值為7.93±0.026。在密封條件下抽取細(xì)胞培養(yǎng)基測(cè)量pH值,于15min,30min,1h和24h的結(jié)果分別為:7.402±0.0156,7.341±0.0354,7.308±0.0

8、365和7.311±0.0304。除15min細(xì)胞培養(yǎng)基pH略升高外,其余時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞培養(yǎng)基pH值均無(wú)明顯變化,維持在7.0-8.0之間。采用U87、U251和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞,以95%N2+5%CO2替換盒內(nèi)氣體為對(duì)照(氧濃度低于0.2%),所致的細(xì)胞損傷及細(xì)胞活性檢測(cè),均無(wú)明顯差異(P>0.05)。
　　【結(jié)論】根據(jù)焦性沒(méi)食子酸的特殊化學(xué)性質(zhì)以及緩沖液的特點(diǎn),設(shè)計(jì)的缺氧盒之缺氧效果好,盒內(nèi)二氧化碳濃度穩(wěn)定,經(jīng)觀察與

9、95%N2+5%CO2組比較無(wú)明顯差異,它能夠滿足缺氧實(shí)驗(yàn)的需求。
　　實(shí)驗(yàn)二、白藜蘆醇預(yù)處理對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞氧糖剝奪損傷的保護(hù)作用
　　【研究背景】神經(jīng)系統(tǒng)受損后修復(fù)能力有限,神經(jīng)干細(xì)胞及神經(jīng)前體替換損傷神經(jīng)細(xì)胞為神經(jīng)系統(tǒng)的修復(fù)提供了有利條件。但是,缺血性腦卒中及再通后,其內(nèi)環(huán)境發(fā)生了較大的變化,這對(duì)干細(xì)胞的存活與生長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的影響。白藜蘆醇(Resveratrol,Res)是多酚類藥物,廣泛存在于自然界植物中。研究發(fā)現(xiàn),R

10、es可以激活SIRT1,并通過(guò)SIRT1相關(guān)通路對(duì)細(xì)胞保護(hù)發(fā)揮作用,可提高神經(jīng)細(xì)胞的耐缺氧能力。本課題從缺血損傷的基本因素出發(fā),研究Res預(yù)防神經(jīng)損傷的機(jī)制,以及增強(qiáng)神經(jīng)干細(xì)胞生存能力的有效方法,將為神經(jīng)損傷修復(fù)及神經(jīng)干細(xì)胞的臨床應(yīng)用提供新的證據(jù)和研究思路。
　　【目的】探討Res預(yù)處理對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞氧糖剝奪損傷的有效保護(hù)作用。
　　【方法】取自孕15dSD大鼠胎腦組織進(jìn)行分離、培養(yǎng),通過(guò)免疫組化鑒定巢蛋白表達(dá)情況,鑒定其神經(jīng)

11、干細(xì)胞的特性;用含有Res10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L和60μmol/L培養(yǎng)液預(yù)處理,培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞1h,同時(shí)對(duì)照組加入含0.1%DMSO培養(yǎng)液。更換低糖培養(yǎng)基后,將細(xì)胞置于本研究創(chuàng)用的缺氧盒內(nèi),進(jìn)行培養(yǎng)氧糖剝奪的實(shí)驗(yàn),時(shí)間為6h;采用四唑鹽比色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活性;收集培養(yǎng)基上清,通過(guò)測(cè)量上清中乳酸脫氫酶活性,檢測(cè)細(xì)胞損傷情況。
　　【結(jié)果】原代胎鼠腦組織分離培養(yǎng)5d后可見(jiàn)神經(jīng)球形成,細(xì)胞爬片及神經(jīng)球免疫組化

12、鑒定結(jié)果,見(jiàn)巢蛋白表達(dá)陽(yáng)性,所培養(yǎng)的細(xì)胞為神經(jīng)干細(xì)胞;Res處理1h后OGD6h測(cè)細(xì)胞活性。10μmol/L和20μmol/L組MTT值相對(duì)于對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=7,p<0.01),表明10μmol/L和20μmol/LRes預(yù)處理1h對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞耐氧糖剝奪損傷有保護(hù)作用;20μmol/L組LDH活性相對(duì)于對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=5,p<0.01),細(xì)胞損傷較輕。
　　【結(jié)論】Res預(yù)處理1h對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞氧糖剝奪損傷有保護(hù)作用