骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植治療擴(kuò)張型心肌病的動(dòng)物與臨床研究.pdf

1、擴(kuò)張型心肌病(dilatedcardiomyopathy，DCM)是一種由多種因素導(dǎo)致的心肌細(xì)胞肥大變性、功能退化，繼而發(fā)生彌漫性心肌纖維化、收縮功能減退的心肌疾病，隨著病情進(jìn)展，最終發(fā)展為全心腔擴(kuò)大、充血性心力衰竭。其病因及發(fā)病機(jī)制尚不清楚，早期診斷比較困難，出現(xiàn)癥狀后病人病情常呈進(jìn)行性惡化。DCM以心肌受累為主，特點(diǎn)是具有完整舒縮功能的心肌細(xì)胞數(shù)量減少。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，成體心肌細(xì)胞是高度分化的終末細(xì)胞，不再具備增殖能力，因此認(rèn)為這些損

2、傷是不可逆的，缺乏有針對(duì)性的特效治療，確診者約1/4在一年內(nèi)死亡，半數(shù)在5年內(nèi)死亡，預(yù)后較差。隨著干細(xì)胞技術(shù)的出現(xiàn)與成熟，將心外組織中具備分化潛能的各種干細(xì)胞導(dǎo)入，替代或再生心肌細(xì)胞，恢復(fù)心功能將成為最直接、最有效的途徑。骨髓干細(xì)胞是多種細(xì)胞及組織的多潛能前體細(xì)胞，沒有明確的形態(tài)學(xué)特征，為單個(gè)核細(xì)胞(mononuclearbonemarrowcells，MBMCs)，它具有自我更新和分化潛能，又能釋放某些細(xì)胞因子促進(jìn)血管新生。大量體外試

3、驗(yàn)結(jié)果證實(shí)它在特定環(huán)境中能被誘導(dǎo)分化為心肌樣細(xì)胞，誘導(dǎo)后細(xì)胞具有心肌特異性結(jié)構(gòu)蛋白及電興奮，可用來修復(fù)損傷壞死心肌。 目的 ①動(dòng)物試驗(yàn)：通過心肌直接注射的方法，使大量MBMCs進(jìn)入DCM心肌壞死區(qū)，進(jìn)行病損心臟的細(xì)胞及血管重建，評(píng)價(jià)MBMCs移植修復(fù)心肌、血管并恢復(fù)衰竭心臟心功能的價(jià)值，為MBMCs移植治療DCM等彌漫性、非缺血性心肌損害疾病提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 ②臨床試驗(yàn)：收集終末期心功能不全的DCM患者，進(jìn)行自體M

4、BMCs移植，觀察其療效，并探討其治療最佳途徑及改善遠(yuǎn)期預(yù)后的機(jī)制，為臨床治療DCM提供全新策略。 方法 ①構(gòu)建實(shí)驗(yàn)性大鼠DCM模型。近交系大鼠皮下注射大劑量異丙腎上腺素(isoproterenol，ISO)(170mg/kg，1次/d，連續(xù)2d)，喂養(yǎng)4周后，通過血流動(dòng)力學(xué)、超聲心動(dòng)圖檢測，以及免疫組織化學(xué)、電鏡檢查，從不同方面證實(shí)模型制造成功。 ②抽取骨髓干細(xì)胞，分離純化得MBMCs，用4'，6-二脒基-2-

5、苯基吲哚(DAPI)標(biāo)記后，以10μl懸液(含5×106個(gè)細(xì)胞)或10μlPBS直接心肌注射(左心室前壁，移植組/對(duì)照組)，假手術(shù)組僅開、關(guān)胸。在移植后4、8周，分別觀察植入細(xì)胞在心肌組織內(nèi)的生長、分化及增殖情況；用微壓力傳感器及彩色多普勒超聲評(píng)價(jià)細(xì)胞移植前后、移植后不同時(shí)間段心臟功能變化；采用免疫組織化學(xué)及電鏡觀察移植前后、移植后不同時(shí)間段心肌修復(fù)情況。 ③收集臨床終末期DCM病例1例，入選標(biāo)準(zhǔn)為年齡＜75歲，左室EF＜45％

6、，常規(guī)藥物治療效果不佳。進(jìn)行自體MBMCs移植，通過導(dǎo)管術(shù)移植入冠脈前降支，在注射前和注射后，分別通過心肌核素灌注掃描、心血池造影、超聲心動(dòng)圖等檢測，對(duì)左心功能、心室的幾何形狀和心肌灌注情況進(jìn)行評(píng)估，以評(píng)價(jià)細(xì)胞移植的療效。 結(jié)果 ①動(dòng)物DCM模型：皮下注射ISO后4周，心超、血流動(dòng)力學(xué)分別檢測到室壁變薄、搏動(dòng)減弱，心腔擴(kuò)大，EF降低，心功能明顯受損，病理及電鏡發(fā)現(xiàn)類似人類DCM的早期變化。以EF＜45％為入選下一步實(shí)驗(yàn)標(biāo)

7、準(zhǔn)。 ②細(xì)胞移植后4、8周，復(fù)查心臟超聲及血流動(dòng)力學(xué)，移植組左室收縮和舒張末容積(LVESV、LVEDV)減小，短軸縮短率(FS)和射血分?jǐn)?shù)(EF)顯著增大；左室收縮壓力(Ps)、壓力速率最大值(dp/dt)明顯升高，而左室舒張末壓力(PED)顯著下降，且隨時(shí)間改變，移植組各項(xiàng)指標(biāo)呈進(jìn)行性好轉(zhuǎn)。對(duì)照組和假手術(shù)組則心腔漸擴(kuò)大，并有部分出現(xiàn)了返流現(xiàn)象；心臟標(biāo)本切片，熒光顯微鏡檢查證實(shí)在心肌壞死區(qū)有細(xì)胞核因被標(biāo)記而呈熒光的新生心肌樣細(xì)

8、胞和血管，免疫組織化學(xué)和電鏡檢查也發(fā)現(xiàn)細(xì)胞移植區(qū)有類似心肌細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)、心肌特異性結(jié)蛋白和肌動(dòng)蛋白，有細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化及內(nèi)膜不完整的新生血管，且陽性物質(zhì)隨時(shí)間推移而逐漸增多。對(duì)照組和假手術(shù)組則沒有這些改變，并且在不同時(shí)間段出現(xiàn)死亡病例。 ③DCM病人細(xì)胞移植后80天復(fù)查，超聲檢查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EF增加8％，LVEDV、LVESV分別下降20ml和47ml；SPECT檢測，下壁和間壁心肌受損區(qū)核素灌注增強(qiáng)，攝取率分別提高5％和15％

9、，心血池造影顯示左室EF、1/3EF分別提高2％和5％，局部EF仍普遍異常，左室1/3充盈率(1/3FR)則由0.964提高到1.337。移植治療后沒有出現(xiàn)心肌缺血損害、炎癥反應(yīng)和惡性心律失常等不良反應(yīng)。 結(jié)論 MBMCs移植是安全可行，并行之有效的。它能在DCM變性壞死的心肌組織內(nèi)存活，增殖，并分化為新生的心肌樣細(xì)胞和血管，從而修復(fù)壞死心肌，使心臟功能得到不同程度提高，改善病人長期預(yù)后。細(xì)胞移植的出現(xiàn)必將給DCM等彌漫