順鉑誘導Hela細胞凋亡后超微弱發(fā)光與氧自由基水平的變化.pdf

1、宮頸癌仍是婦科中高發(fā)的惡性腫瘤，目前在臨床治療中，化療是一個基本而重要的抗腫瘤手段。然而在化療過程中仍會產(chǎn)生因化療藥物使用后出現(xiàn)藥物不敏感或多藥耐藥（Multidrug resistance，MDR），造成治療失敗。近年來研究表明，大多數(shù)化療藥物都是通過誘導腫瘤細胞凋亡發(fā)揮其作用，可又如何評價其化療效果，臨床上至今仍缺乏客觀的檢測指標，而超微弱發(fā)光為解決這一問題提供了新的可能。任何有生命的物質(zhì)可以輻射出一種極其微弱的光子流，這種現(xiàn)象稱為

2、生物的超微弱發(fā)光現(xiàn)象（Ultraweak Photon Emission，UPE），亦被稱為生物系統(tǒng)超微弱光子輻射（Ultraweak Photn Emission From Bioluminescence）是普遍存在于有機體內(nèi)的一種自發(fā)的化學發(fā)光現(xiàn)象。其發(fā)光強度非常弱，僅為10-104Photons/cm2·s，波長范圍200～800nm，是生物體進行新陳代謝過程中細胞自發(fā)的輻射極其微弱的光子流，它廣泛存在于動物、植物以及單細胞生物之

3、中。大量研究表明，超微弱發(fā)光與生物體的許多重要生命過程，如氧化代謝、去毒作用、細胞分裂、光合作用和生長調(diào)節(jié)等，尤其是腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系。不同細胞或同種細胞的不同生理與病理狀態(tài)，其發(fā)光強度都存在著明顯的差別，而有關(guān)化療藥物的應用對腫瘤細胞的超微弱發(fā)光的影響，目前研究甚少。
　　本實驗通過使用化療藥物順鉑(cisplatin DDP)，在非毒性劑量下，來誘導人宮頸癌Hela細胞凋亡后，研究其超微弱發(fā)光強度的變化以及細胞內(nèi)氧自由

4、基水平變化的特點，從而探討腫瘤化療與細胞超微弱發(fā)光之間的聯(lián)系及指導臨床實踐奠定基礎(chǔ)。
　　目的：探討DDP作用于人宮頸癌Hela細胞發(fā)生凋亡，并比較用藥前后細胞超微弱發(fā)光強度以及細胞內(nèi)氧自由基水平的變化特點。
　　方法：
　　1．選擇化療藥物DDP作用于Hela細胞，采用MTT法有效的選擇DDP半抑制濃度IC50，來評價DDP對Hela細胞的細胞毒性；
　　2．分別用光鏡、HE染色、流式細胞術(shù)、免疫組化法和電鏡來

5、觀察Hela細胞凋亡前后的形態(tài)變化；
　　3．用IFFM-D型流動式化學發(fā)光儀檢測Hela細胞凋亡前后，在不同條件下的超微弱發(fā)光強度的變化；
　　4．用化學比色法檢測凋亡前后Hela細胞內(nèi)MDA、SOD以及GSH含量的變化。
　　結(jié)果：
　　1．DDP的細胞毒性效果評定：當DDP濃度為3mg/L以下時，對Hela細胞無明顯毒性作用（P<0.01），超過3mg/L以上時，其毒性呈劑量效應（P<0.01）；隨著DDP

6、劑量增加，對細胞存活產(chǎn)生明顯影響。
　　2．DDP作用于Hela細胞凋亡前后的形態(tài)變化：
　?。?）光學顯微鏡觀察：經(jīng)3mg/LDDP分別作用12h，24h，48h，72h，96h后，對照組中Hela細胞體積較大，呈多邊形，折光性好；實驗組經(jīng)DDP作用不同時間后逐漸出現(xiàn)脫壁和凋亡現(xiàn)象。
　　（2）掃描電鏡下：Hela細胞組細胞表面有豐富的微絨毛，細胞間隙清晰可見，線粒體嵴完整；實驗組細胞出現(xiàn)，凋亡細胞表面微絨毛消失，細

7、胞之間出現(xiàn)間隔，細胞膜較多的球狀突起。透射電鏡下：Hela細胞核大而形狀不規(guī)則，胞漿內(nèi)含有豐富的游離核糖體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體，實驗組凋亡和變性死亡的細胞增多，可見大小不等的凋亡細胞和凋亡小體及細胞腫脹、溶解壞死。
　?。?）流式細胞儀：經(jīng)DDP作用后Hela的G2期細胞顯著增多，而S期細胞明顯減少（P<0.01）；且細胞凋亡率隨DDP作用時間的不同明顯增高，分別在24h，48h，72h為(11.4±5.8,21.8±7.9,32

8、.5±11.6)％，（P<0.05）；
　?。?）免疫組化結(jié)果顯示：對照組Hela細胞膜上p27表達為陰性，實驗組Hela細胞膜上p27為陽性，且高表達約為80％；
　　3．Hela細胞經(jīng)3mg/LDDP作用后，在不同條件下細胞超微弱發(fā)光強度隨之增強，但明顯低于對照組（P<0.01）；
　　4．經(jīng)DDP作用后Hela細胞內(nèi)SOD的活性顯著降低（P<0.05），MDA的含量則有所升高（P<0.01），GSH的含量也明顯降

9、低（P<0.05）；
　　結(jié)論：
　　1．DDP能有效抑制Hela細胞的生長。本實驗示DDP的非毒性劑量為3mg/L；
　　2．DDP作用后的Hela細胞超微弱發(fā)光強度值顯著降低。其原因可能與細胞增殖速度減慢，使蛋白質(zhì)氧化，DNA鏈斷裂，細胞內(nèi)氧化代謝減弱等因素有關(guān)；
　　3．DDP作用后的Hela細胞內(nèi)氧自由基的含量升高，抗氧化劑的活性明顯減低，使過多的氧自由基積聚，影響細胞的功能狀態(tài)，導致細胞凋亡或死亡，可能