PELA為載體的GST緩釋疫苗微球的制備工藝研究.pdf

1、谷胱甘肽S—轉移酶(GlutathioneS—transferase，GST)是目前國際上公認的血吸蟲疫苗的主要侯選蛋白之一，通過基因工程技術對GST蛋白進行克隆和表達，可解決以往疫苗篩選所涉及的蟲源困難問題，并可保證疫苗的安全性。由于GST疫苗在體內(nèi)易快速降解和消除，且單獨使用免疫效果欠佳等缺陷，大大影響了疫苗的臨床應用。生物可降解聚合物微球是一種具有佐劑效應的疫苗緩控釋系統(tǒng)，它可以提供大量抗原并防止其在生理條件下的快速降解，通過微球

2、對所包埋抗原的持續(xù)或脈沖釋放行為，有效模擬傳統(tǒng)疫苗的多次免疫過程，可以在相當長時間內(nèi)持續(xù)提供抗原，從而減少接種次數(shù)和免疫原的使用總量，增強病人的適應性，降低用藥成本。本論文圍繞生物可降解微球載體的制備工藝、體外質量評價以及緩釋疫苗微球的制備和評價開展了一系列的研究工作，論文共分為以下四個部分： 第一部分綜述 對目前生物技術藥物，特別是蛋白多肽類和疫苗類藥物的緩釋微球的研究進展進行了綜述，主要包括制備微球常用的載體材料、常

3、用的制備方法、緩釋微球的體外釋放特征、緩釋微球的穩(wěn)定性研究等幾個方面的內(nèi)容；概述了目前國內(nèi)外緩釋疫苗微球給藥系統(tǒng)的發(fā)展趨勢，為論文后續(xù)實驗工作的開展奠定基礎。 第二部分PELA微球載體的制備.以乙酸乙酯為有機溶劑，牛血清白蛋白(Bovineserumalbumin，BSA)為模型藥物，采用復乳溶媒揮發(fā)法制備了聚乳酸—聚乙二醇共聚物(Poly—D，L—lactide—co—poly(ethyleneglycol)，PELA)微球。

4、以微球的包封率和載藥量為指標，考察了有機溶劑種類、載體材料、穩(wěn)定劑類型、聚乙烯醇(Polyvinylalcohol，PVA)濃度以及內(nèi)相水油比例等因素對微球制備的影響，同時考察了各處方所得微球的形態(tài)。在單因素試驗的基礎上，選取對微球制備影響較大的3個因素：藥載比、PELA濃度、PVA體積進行正交試驗，確定優(yōu)化處方。最后確定的處方工藝是：乙酸乙酯為有機溶劑；PELA為載體材料，其濃度為50mg·mL-1；2％PVA為外水相穩(wěn)定劑，其體積為

5、20mL；內(nèi)相水油比為1：10：藥載比為1：5。 第三部分PELA微球載體的體外質量評價.主要圍繞所制PELA微球的形態(tài)、粒徑、載藥量、包封率、體外釋藥性質等展開一系列的研究工作。經(jīng)實驗摸索，建立了測定PELA微球載藥量和包封率的紫外—可見分光光度法，具體方法：用0.3mol·L-1NaOH—SDS(2％)溶液溶解微球，游離藥物經(jīng)HCL中和后用紫外—可見分光光度法測定PELA微球載藥量和包封率。掃描電子顯微鏡觀察微球的形態(tài)；激光

6、粒度儀測定微球的粒徑分布；初步研究了微球的體外釋藥特征，并對影響藥物突釋的因素進行了分析。結果表明：本實驗建立的紫外—可見分光光度法測定PELA微球載藥量和包封率，方法快速簡便，重現(xiàn)性好，測得BSA—PELA微球的平均載藥量和包封率分別是12.44％和86.31％。掃描電子顯微鏡觀察微球呈類球形，顆粒均小于10μm，激光粒度儀測得微球的平均粒徑為6.585μm，結果與電鏡照片相吻合。體外釋藥結果顯示，微球的釋放可以分為兩個階段，0—3天

7、釋放曲線可用Higuchi方程擬合(Q=0.2681t1/2—0.0064，r=0.9983)，4-28天的釋放曲線可用零級動力學方程擬合(Q=0.0051t+0.5023，r=0.9949)，28天累積釋藥為64.83％，具有明顯的緩釋效果。 第四部分GST微球的制備及其質量評價主要圍繞緩釋疫苗微球的制備、形態(tài)和粒徑、載藥量和包封率、體外釋藥特征、微球包裹前后疫苗蛋白的結構變化、微球中溶劑殘留等展開了一系列的研究工作。建立了緩

8、釋疫苗微球載藥量和包封率的測定方法，即先將疫苗微球消解后，采用BCA法測定疫苗微球的載藥量和包封率；掃描電子顯微鏡觀察疫苗微球的形態(tài)；激光粒度儀測定疫苗微球的粒徑分布；初步研究了疫苗微球的體外釋藥特征；十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS—PAGE)法觀察包裹前后蛋白質結構的變化；毛細管氣相色譜法(GC)分析微球中乙酸乙酯殘留量。結果表明：疫苗微球的平均載藥量和包封率分別是5.12％和75.25％；電子顯微鏡觀察疫苗微球呈球形；激

9、光粒度儀測得疫苗微球的平均粒徑為5.387μm，結果與電鏡照片相吻合；SDS—PAGE電泳結果顯示，包裹前后GST的分子量沒有發(fā)生變化，保持其分子結構的完整；體外釋藥結果顯示，疫苗微球的釋放可以分為兩個階段，0—3天釋放曲線可用Higuchi方程擬合(Q=0.2537t1/2—0.0005，r=0.9977)，4-28天的釋放曲線可用零級動力學方程擬合(Q=0.0071t+0.4875，r=0.9922)，28天累積釋藥為69.10％，