乙醛脫氫酶2(ALDH2)促進(jìn)慢性缺血組織血管新生作用的基礎(chǔ)與臨床研究.pdf

1、缺血性心臟病是人類(lèi)健康主要?dú)⑹种弧?jù)統(tǒng)計(jì)，美國(guó)20歲以上成年缺血性心臟病總患病率為7.0％，是死亡最常見(jiàn)原因之-[1，2]。在我國(guó)，隨著經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)和生活水平的提高，缺血性心臟病的患病率和死亡率逐年上升。盡管藥物治療、介入治療、外科手術(shù)治療取得了很大進(jìn)步，但約20％患者不能進(jìn)行這類(lèi)治療或者治療效果不佳[3]。臨床研究已證實(shí)良好的側(cè)枝循環(huán)可以保護(hù)缺血心肌，提高缺血性心臟病病人的生存率[4，5]。如何促進(jìn)側(cè)枝循環(huán)的建立已成為目前防治缺血性心臟

2、病的一大熱點(diǎn)。嚴(yán)重缺血性心臟病患者中，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascularendothelial growth factor，VEGF)、缺氧誘導(dǎo)因子-1α(Hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)已被證實(shí)能促進(jìn)側(cè)枝循環(huán)的形成[6，7]。
　　乙醛脫氫酶2(Aldehyde dehydrogenase，ALDH2)位于線粒體，是一種主要的醛類(lèi)氧化酶。ALDH2基因存在一些常見(jiàn)突變，東亞人群中Glu504

3、Lys突變具有很高的出現(xiàn)頻率，在中國(guó)漢族人群中攜帶者約為34％，日本人群中約占46％。攜帶該突變將引起個(gè)體酶活性降低，雜合子僅為野生型個(gè)體ALDH2活性的十六分之一，突變純合子體內(nèi)幾乎沒(méi)有該酶活性[8,9]。早期主要認(rèn)為ALDH2主要是酒精代謝中的關(guān)鍵酶，催化具有毒性的乙醛代謝為無(wú)毒性的乙酸的反應(yīng)，乙酸在體內(nèi)可以繼續(xù)參與供能反應(yīng)。2008年Science報(bào)道，ALDH2通過(guò)激活蛋白激酶Cε(Protein kinase Cε， PKCε

4、)途徑，在缺血再灌注損傷模型中發(fā)揮顯著保護(hù)作用[10]。近年來(lái)，ALDH2逐漸被被證實(shí)為一種重要的內(nèi)源性心臟保護(hù)因子，在心梗后心衰、心臟缺血再灌注損傷、酒精性心肌病等方面發(fā)揮重要保護(hù)作用[11]。
　　本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn):ALDH2可以對(duì)心梗后慢性缺血心肌發(fā)揮保護(hù)作用，這是通過(guò)減少脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物毒性醛類(lèi)物質(zhì)如4-羥基壬烯醛(4-Hydroxynonenal，4-HNE)的產(chǎn)生，從而抑制JNK/p53途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)。2007年Natu

5、re有文章表明[12]，主動(dòng)脈縮窄引起的心臟壓力負(fù)荷模型中，心肌細(xì)胞肥大而與之匹配的血管新生不足，導(dǎo)致心肌細(xì)胞相對(duì)缺血，p53通過(guò)下調(diào)HIF-1a抑制血管新生，加重心肌缺血使心功能進(jìn)一步惡化;反之，抑制p53能通過(guò)促進(jìn)心肌細(xì)胞周?chē)苄律?，有效改善心肌供血，從而提高小鼠心臟射血分?jǐn)?shù)。因此，ALDH2是否參與調(diào)控血管新生？同時(shí)，ALDH2參與線粒體活性氧(Reactive oxygenspecies，ROS)的產(chǎn)生[13]，而ROS亦可以

6、調(diào)控HIF-1/VEGF途徑[14]。因此本研究將從血管新生的角度研究，ALDH2作為一種內(nèi)源性缺血保護(hù)因子，是否通過(guò)HIF-1/VEGF途徑在慢性缺血過(guò)程中調(diào)控血管新生，從而改善組織血供代償，促進(jìn)缺血組織功能。
　　冠狀動(dòng)脈慢性閉塞病變(Coronary total occlusion，CTO)由于病變的嚴(yán)重程度和復(fù)雜程度，具有難治性，被認(rèn)為是冠脈介入治療領(lǐng)域“最后的前沿”，側(cè)枝循環(huán)的形成對(duì)CTO患者維持基礎(chǔ)心功能至關(guān)重要[15

7、]?？紤]到ALDH2在亞洲人中具有接近半數(shù)的突變攜帶率，因此ALDH2基因型對(duì)CTO患者的側(cè)枝循環(huán)形成能力的作用，對(duì)于臨床工作中CTO病變高危人群的預(yù)防、治療策略的選擇和預(yù)后判斷都將具有重要意義。本研究將通過(guò)收集CTO患者，來(lái)研究ALDH2基因分型和與其冠脈側(cè)枝循環(huán)Rentrop分級(jí)的關(guān)系及其臨床影響因素，從而說(shuō)明ALDH2在臨床缺血性心肌病中的作用。
　　綜上所述，本研究旨在研究ALDH2對(duì)慢性缺血組織血管新生的作用，并進(jìn)一步闡

8、明其分子作用機(jī)制，并通過(guò)對(duì)ALDH2基因型與CTO患者冠狀動(dòng)脈側(cè)枝循環(huán)關(guān)系的臨床研究來(lái)驗(yàn)證ALDH2對(duì)血管新生的作用和在人群中特別是東亞人群中的影響。本研究有望從血管新生角度探討出ALDH2對(duì)慢性缺血心肌發(fā)揮保護(hù)的作用機(jī)制，闡明ALDH2基因型差異對(duì)CTO患者臨床表型及預(yù)后的影響，并有望為此類(lèi)患者的個(gè)體化治療原則提供參考依據(jù)，如對(duì)ALDH2缺失型患者采取更積極的血運(yùn)重建。全文共分為以下三部分:
　　第一部分 ALDH2調(diào)控慢性缺血

9、組織的血管新生能力
　　背景: 血管新生對(duì)于缺血性心臟病的發(fā)展和預(yù)后至關(guān)重要，乙醛脫氫酶2(Aldehyde dehydrogenase，ALDH2)的心肌保護(hù)作用近年來(lái)備受關(guān)注，本研究旨在探索ALDH2對(duì)慢性缺血組織血管新生的調(diào)節(jié)作用。
　　方法: 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，采用8周雄性ALDH2基因敲除小鼠(ALDH2-KO)和野生型C57BL/6小鼠(WT)制作下肢缺血模型，于術(shù)后1天、7天和21天用激光多普勒儀測(cè)量下肢血流灌注水平。

10、細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞(Microvascular endothelial cells，MECs)，通過(guò)轉(zhuǎn)染ALDH2-siRNA建立ALDH2低表達(dá)細(xì)胞;分別設(shè)立正常氧分壓組和缺氧發(fā)生劑模擬缺氧6小時(shí)組，通過(guò)Metrigel膠培養(yǎng)觀察各組微血管內(nèi)皮細(xì)胞的成管能力。
　　結(jié)果: 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，激光多普勒檢測(cè)以小鼠健測(cè)為對(duì)照統(tǒng)計(jì)患側(cè)/健側(cè)血流灌注比，發(fā)現(xiàn)ALDH2-KO小鼠下肢血流恢復(fù)水平比野生型小鼠更差，21天時(shí)具有

11、顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)。ALDH2-KO小鼠腓腸肌萎縮更加顯著，并且免疫組化顯示ALDH2-KO小鼠缺血區(qū)域的小動(dòng)脈新生少。細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)，觀察到對(duì)大鼠心肌MECs給予ALDH2-siRNA干擾后，在正常氧分壓組及缺氧6小時(shí)組，與對(duì)照組相比ALDH2低表達(dá)細(xì)胞Metrigel膠成管能力顯著減弱。
　　結(jié)論: 上述結(jié)果說(shuō)明，ALDH2缺陷能夠抑制慢性缺血組織的血管新生，阻礙自身血運(yùn)重建和功能重建。從血管新生的角度解釋了ALDH

12、2對(duì)慢性缺血心肌的保護(hù)作用，為臨床缺血性疾病治療提供新的藥物作用靶點(diǎn)。
　　第二部分 ALDH2通過(guò)上調(diào)HIF-1α/VEGF途徑促進(jìn)血管新生
　　背景: 近年來(lái)，ALDH2逐漸被被證實(shí)為一種重要的內(nèi)源性心臟保護(hù)因子，在心梗后心衰、心臟缺血再灌注損傷、酒精性心肌病等方面發(fā)揮非常關(guān)鍵的保護(hù)作用。第一部分研究發(fā)現(xiàn)ALDH2缺陷能夠顯著減弱慢性缺血組織的血管新生，本研究旨在闡明其內(nèi)在分子機(jī)制。
　　方法: 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，分組及造

13、模同第一部分，分別取術(shù)后1天、7天和21天小鼠雙側(cè)股四頭肌提蛋白。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞系(HumanUmbilical Vein Endothelial Cells，HUVECs)進(jìn)行信號(hào)通路的研究，通過(guò)轉(zhuǎn)染病毒建立ALDH2低表達(dá)及高表達(dá)細(xì)胞模型，設(shè)立正常氧分壓組和缺氧6小時(shí)組。分別對(duì)上述小鼠股四頭肌組織和細(xì)胞，采用Western Blot方法檢測(cè)ALDH2、缺氧誘導(dǎo)因子-1α(Hypoxia inducible fac

14、tor-1α，HIF-1α)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)等蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果: 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，ALDH2-KO小鼠缺血側(cè)股四頭肌組織在缺血后1周時(shí)與野生型小鼠相比，HIF-1α和VEGF蛋白水平顯著降低(p＜0.05)。培養(yǎng)HUVECs細(xì)胞進(jìn)行Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，上調(diào)ALDH2的表達(dá)， HIF-1α、VEGF蛋

15、白水平增加;而轉(zhuǎn)染質(zhì)粒抑制ALDH2表達(dá)，則HIF-1α、VEGF蛋白水平顯著降低。
　　結(jié)論: 上述結(jié)果說(shuō)明，ALDH2能夠通過(guò)調(diào)節(jié)HIF-1α/VEGF通路，對(duì)慢性缺血組織的血管新生發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，從而通過(guò)改善缺血組織血供促進(jìn)功能重建。本研究解釋了ALDH2調(diào)控血管新生的內(nèi)在分子機(jī)制。
　　第三部分 ALDH2基因型對(duì)CTO患者冠狀動(dòng)脈側(cè)枝循環(huán)分級(jí)的臨床研究
　　背景: 冠狀動(dòng)脈慢性閉塞病變(Coronary tot

16、al occlusion，CTO)被認(rèn)為是冠脈介入治療領(lǐng)域“最后的前沿”，冠狀動(dòng)脈側(cè)枝循環(huán)(Coronary collateral vessels，CCVs)的形成對(duì)CTO患者維持基礎(chǔ)心功能至關(guān)重要。ALDH2 Glu504Lys突變?cè)趤喼奕巳褐芯哂薪咏霐?shù)的突變攜帶率。本研究旨在從臨床的角度，闡明ALDH2基因型對(duì)慢性缺血心肌血管新生作用。
　　方法: 通過(guò)中山醫(yī)院倫理審查和獲得患者同意后，從在上海中山醫(yī)院進(jìn)行冠狀動(dòng)脈造影的患者

17、中，選擇收集冠狀動(dòng)脈慢性閉塞病變(Chronic total occlusion，CTO)患者;入選條件:左主干、左前降支、回旋支和/或右冠狀動(dòng)脈至少一支完全閉塞，病程大于等于3個(gè)月;排除條件:急性心肌梗塞(acute myocardialinfarction，AMI)，經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(Percutaneous coronary intervention，PCI)術(shù)后，冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)(Coronary artery bypas

18、s grafting，CABG)術(shù)后，或合并先心、瓣膜病和外周血管疾病等。根據(jù)患者冠脈造影圖像進(jìn)行側(cè)枝循環(huán)Rentrop分級(jí)（0級(jí)和1級(jí)合并為側(cè)枝循環(huán)不良組，2級(jí)和3級(jí)合并為側(cè)枝循環(huán)良好組），對(duì)ALDH2基因測(cè)序分型，收集患者臨床資料，采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果: 根據(jù)入選和排除條件共有153名CTO患者納入研究，發(fā)現(xiàn)在ALDH2野生型中(n=83)側(cè)枝循不良者占38.5％;突變雜合型攜帶患者中(n=63)側(cè)

19、枝不良者占44.4％;而在突變純合型攜帶患者中(n=7)側(cè)枝不良者(n=5)占71.4％，與野生型和雜合型相比側(cè)枝循環(huán)更差(p＜0.05)。
　　結(jié)論: 上述結(jié)果從臨床水平亦證明ALDH2活性對(duì)血管新生十分重要。并且臨床中在慢性缺血性心臟病病患者中，ALDH2缺陷的個(gè)體顯示出了更差的心臟側(cè)枝循環(huán)形成能力，Glu504Lys突變純合型個(gè)體（占亞洲人口的6～10％）。本研究為臨床對(duì)攜帶ALDH2突變的CTO患者采取更加積極的血運(yùn)重建治