電針關(guān)元、足三里對(duì)衰老模型大鼠T細(xì)胞免疫調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、目的：深入觀察電針關(guān)元、足三里對(duì)D—半乳糖衰老模型大鼠的神經(jīng)—內(nèi)分泌—免疫網(wǎng)絡(luò)相關(guān)物質(zhì)的調(diào)節(jié)效應(yīng)，探索針灸調(diào)控T細(xì)胞免疫延緩衰老的科學(xué)方法和作用機(jī)制． 方法：立足中醫(yī)和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)于衰老的科學(xué)認(rèn)識(shí)，制作D—半乳糖致衰老大鼠80只(雌雄各半)作為衰老模型，隨機(jī)分組設(shè)衰老模型(Model)組×2、衰老模型電針(EA)組×2、衰老模型免疫抑制(ISU)組、衰老模型電針加免疫抑制(EA+ISu)組、衰老模型米非司酮(RU486)組、衰老模

2、型米非司酮加電針(Ru486+EA)組，每組各10只，另以3月齡大鼠作為正常青年對(duì)照(Normal)組10只(雌雄各半)×2。采用電針(HANS，LH202型電針儀，連續(xù)波，頻率2Hz，強(qiáng)度為1mA，通電15分鐘)關(guān)元、后三里治療，每日1次，每周日休息1天，共治療27天；采用MTT法檢測T細(xì)胞增殖能力，雙抗夾心ELISA法檢測脾臟T細(xì)胞誘生IL-2和IL-2R水平，放射免疫法檢測血清IL-6、ACTH，CORT含量，流式細(xì)胞術(shù)檢測血清C

3、D8+CD28+T細(xì)胞表達(dá)，免疫組織化學(xué)ABC法檢測海馬區(qū)IL-6R、下丘腦β—end和CRH免疫陽性物表達(dá)，熒光定量逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應(yīng)(RT—PCR)法檢測海馬和胸腺細(xì)胞GRmRNA表達(dá)等，分析各組大鼠免疫系統(tǒng)和神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)相關(guān)指標(biāo)的變化及聯(lián)系。為探討電針強(qiáng)壯穴的“治未病”效應(yīng)，借助環(huán)磷酰胺腹腔注射，檢驗(yàn)電針強(qiáng)壯穴(關(guān)元、足三里)對(duì)衰老機(jī)體的免疫抗病能力影響；另借助糖皮質(zhì)激素受體拮抗劑米非司酮(RU486)皮下注射，探討海馬對(duì)下丘

4、腦—垂體—腎上腺(HPA)軸的負(fù)反饋調(diào)節(jié)在電針調(diào)節(jié)免疫效應(yīng)中的作用。 結(jié)果： 1．Model組T細(xì)胞增殖能力、T細(xì)胞分泌IL-2及IL-2R水平、T細(xì)胞表面抗原CD28表達(dá)均明顯低于Normal組(P＜0.01)；電針強(qiáng)壯穴治療后，EA組T細(xì)胞增殖及誘生IL-2和IL-2R的水平、T細(xì)胞表面抗原CD28的表達(dá)均提高(P＜0.01)；電針對(duì)衰老模型大鼠T細(xì)胞增殖能力的調(diào)節(jié)與IL-2及其受體、CD8+CD28+T細(xì)胞密度呈正

5、相關(guān)； 2．ISU組衰老大鼠經(jīng)免疫抑制劑腹腔注射后，與Model組比較T細(xì)胞增殖指數(shù)、T細(xì)胞誘生IL-2、IL-2R分泌、CD8+CD28+T細(xì)胞密度明顯降低(P＜0.01，PIL-2＜0.05)；EA+ISU接受電針處置后，上述指標(biāo)與未電針的ISU組比較卻有顯著性差異(P＜0.01，)與Model組比較未見明顯差異(P＞0.05)； 3．Model組外周血IL-6的分泌和海馬區(qū)IL-6R表達(dá)，比Normal組明顯升高(

6、P＜0.01)，電針強(qiáng)壯穴后，在提高衰老模型大鼠T細(xì)胞增殖能力同時(shí)，能降低外周血IL-6分泌和海馬IL-6R表達(dá)水平(P＜0.01)； 4．下丘腦弓狀核β—end免疫組織化學(xué)結(jié)果，β—end免疫陽性物主要分布在下丘腦弓狀核，高倍鏡下神經(jīng)元和部分神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞胞漿內(nèi)可見棕褐色陽性顆粒，神經(jīng)元軸突免疫反應(yīng)物呈串珠狀。光鏡下Model組神經(jīng)元胞體數(shù)比Normal組分布少，經(jīng)電針強(qiáng)壯穴處理的EA組呈現(xiàn)增多趨勢(shì)；光密度(OD)值分析表明，與

7、Normal組比較，Model組明顯降低(P＜0.01)；經(jīng)電針處置后的大鼠EA組與Model組比較，β—end陽性反應(yīng)物OD值明顯升高(P＜0.05)，與Normal組比較無明顯差異性(P＞0.05)。 5．下丘腦CRH免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果，CRH免疫陽性物主要分布在弓狀核、室旁核，其中室旁核比較明顯，高倍鏡下可見CRH免疫陽性物呈棕褐色，分布于大細(xì)胞神經(jīng)元的胞漿內(nèi)，經(jīng)D—半乳糖處理造模的Model組比組胞漿內(nèi)CRH明顯減少，

8、而經(jīng)過電針強(qiáng)壯穴處理的EA組胞漿內(nèi)CRH呈明顯上升趨勢(shì)；CRH免疫陽性物OD值分析表明，Model組OD值較Normal組大鼠明顯減少(P＜0.05)，經(jīng)電針強(qiáng)壯穴治療后的EA組灰度值顯著升高(P＜0.05)，EA組與Normal組之間OD值比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)； 6．與Normal組比較，Model組T細(xì)胞增殖能力降低，其血清ACTH和CORT含量卻明顯升高(P＜0.01)，而經(jīng)實(shí)驗(yàn)處理的EA組ACTH、CORT含

9、量明顯降低，與Model組組間比較有顯著性差異(P＜0.01)；電針對(duì)衰老模型大鼠T細(xì)胞增殖效應(yīng)的調(diào)節(jié)與電針對(duì)HPA軸ACTH、CORT的分泌水平呈負(fù)相關(guān)，與CRH無明顯相關(guān)性； 7．海馬GRmRNA表達(dá)完整，未被RNA酶降解；基因擴(kuò)增產(chǎn)物只有單一峰值，擴(kuò)增產(chǎn)物具有特異性；目的基因產(chǎn)物片斷長度與設(shè)計(jì)長度相吻合；與Normal組比較，在Model組T細(xì)胞增殖能力降低、血清CORT水平明顯升高同時(shí)，海馬GRmRNA表達(dá)明顯降低(P＜

10、0.01)；經(jīng)電針強(qiáng)壯穴處理后，T細(xì)胞增殖能力升高、血清CORT水平降低，EA組與Model組比較有顯著性差異(P＜0.01)，海馬GRmRNA表達(dá)也明顯升高(P＜0.01)；RU486組海馬GRmRNA表達(dá)比Model組明顯降低(P＜0.01，或P＜0.05)；與RU486組比較，EA+RU486組海馬GRmRNA表達(dá)有所增加，但組間無顯著性差異(P＞0.05)；EA+RU486組GRmRNA的表達(dá)與EA組相比明顯減少(P＜0.01)

11、． 結(jié)論： 通過本課題研究，我們認(rèn)為，電針強(qiáng)壯穴調(diào)控T細(xì)胞免疫延緩衰老的作用機(jī)制是多環(huán)節(jié)、多途徑的： 1、電針強(qiáng)壯穴能通過提高衰老模型大鼠T細(xì)胞增殖、T細(xì)胞誘生IL-2和IL-2R的水平、CD8+T細(xì)胞表面CD28的表達(dá)，調(diào)節(jié)T細(xì)胞免疫功能延緩衰老； 2、電針強(qiáng)壯穴能從T細(xì)胞增殖能力、T細(xì)胞分泌IL-2和IL-2R的水平以及CD8+T細(xì)胞表面抗原CD28表達(dá)等方面對(duì)抗環(huán)磷酰胺的免疫抑制作用，采用這種以治為

12、防的策略，能增強(qiáng)老年個(gè)體免疫防御能力，電針強(qiáng)壯穴延緩衰老具有“治未病”效應(yīng)； 3、電針強(qiáng)壯穴增強(qiáng)T細(xì)胞免疫功能，與電針對(duì)神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)調(diào)節(jié)有關(guān)：(1)電針強(qiáng)壯穴能降低外周血IL-6分泌和海馬IL-6R表達(dá)，并增加海馬GRmRNA表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)海馬對(duì)HPA軸的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，降低體內(nèi)高水平ACTH、CORT對(duì)T細(xì)胞的免疫抑制；(2)電針能提高下丘腦β—end表達(dá)，可能與海馬功能恢復(fù)，增強(qiáng)對(duì)下丘腦β—end的良性調(diào)節(jié)、降低β—end向外

13、周過多分泌造成對(duì)T細(xì)胞免疫功能的抑制效果。同時(shí)可能與提高β—end對(duì)外周ACTH和GC的負(fù)反饋調(diào)節(jié)能力有關(guān)； 4、RU486能阻斷電針調(diào)控海馬對(duì)HPA軸的負(fù)反饋調(diào)節(jié)效應(yīng)，并影響電針對(duì)T細(xì)胞免疫增殖的療效，推測海馬GR是實(shí)現(xiàn)海馬對(duì)HPA的負(fù)反饋調(diào)節(jié)和對(duì)下丘腦良性調(diào)節(jié)、繼而對(duì)T細(xì)胞免疫產(chǎn)生調(diào)控作用的重要物質(zhì)。 綜上所述，我們認(rèn)為電針強(qiáng)壯穴調(diào)控T細(xì)胞免疫是通過神經(jīng)—內(nèi)分泌—免疫網(wǎng)絡(luò)多個(gè)環(huán)節(jié)實(shí)現(xiàn)的，海馬GR是實(shí)現(xiàn)神經(jīng)內(nèi)分系統(tǒng)對(duì)T

14、細(xì)胞免疫產(chǎn)生調(diào)控作用的重要物質(zhì)。血清IL-6，海馬IL-6R，下丘腦β—end以及下丘腦一垂體一腎上腺(HPA)軸上CRH、ACTH和CORT參與了這個(gè)網(wǎng)絡(luò)的具體調(diào)節(jié)過程。 本課題在探討針灸延緩衰老的機(jī)制中，從T細(xì)胞免疫入手，從神經(jīng)—內(nèi)分泌—免疫調(diào)節(jié)(NIM)網(wǎng)絡(luò)綜合探討針灸調(diào)節(jié)免疫延緩衰老的作用機(jī)制，為闡明針灸作用機(jī)制提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，在針灸調(diào)節(jié)免疫延緩衰老的同類報(bào)道中尚不多見；課題采用提前電針干預(yù)衰老模型大鼠，然后對(duì)大鼠進(jìn)