潰瘍性結(jié)腸炎免疫功能變化及振脾湯干預(yù)的基礎(chǔ)與臨床研究.pdf

1、潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis,UC)是一種原因不明的慢性非特異性結(jié)腸炎癥，病變主要位于結(jié)腸的粘膜層和粘膜下層，以炎癥和潰瘍?yōu)橹?，多先累及直腸和遠(yuǎn)端結(jié)腸，但可向近端擴(kuò)展，以至遍及整個(gè)結(jié)腸。主要癥狀有腹瀉及膿血粘液便、腹痛和里急后重。病程漫長(zhǎng)，病情輕重不一，常反復(fù)發(fā)作。本病可見(jiàn)于任何年齡，但20～30歲最多見(jiàn)，男稍多于女。本病在歐洲相當(dāng)常見(jiàn)，患病率約40～100/10萬(wàn)，發(fā)病率為3～11.5/10萬(wàn)。國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)精確統(tǒng)計(jì)

2、報(bào)道，但本病的發(fā)病率較國(guó)外低，近年來(lái)有明顯的增加趨勢(shì)。由于UC病程長(zhǎng)、病變范圍廣泛者被公認(rèn)為是結(jié)腸癌的癌前病變，目前UC已被世界衛(wèi)生組織列為現(xiàn)代難治病之一?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)UC的治療雖然不斷推陳出新，但都存在副作用大，易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)。 近年來(lái)越來(lái)越多的研究表明免疫功能亢進(jìn)在UC發(fā)生發(fā)展中起重要作用。國(guó)內(nèi)外已相繼有一些關(guān)于細(xì)胞因子和T細(xì)胞功能的報(bào)道，但有關(guān)UC與紅細(xì)胞免疫功能的研究甚少。本課題根據(jù)UC的發(fā)病特點(diǎn)及治療進(jìn)展，結(jié)合中藥具有免疫

3、調(diào)節(jié)功能、毒副作用少的特點(diǎn)，選取中藥方劑振脾湯從四個(gè)方面進(jìn)行了研究：(1)采用TNBS/乙醇誘導(dǎo)大鼠潰瘍性結(jié)腸炎動(dòng)物模型，從臨床癥狀改變、病理形態(tài)變化探討與人UC的相似程度。(2)研究TNBS/乙醇致UC大鼠的免疫功能的變化，包括T細(xì)胞亞群、紅細(xì)胞免疫、免疫球蛋白、補(bǔ)體以及炎癥介質(zhì)。(3)選取中藥方劑振脾湯為治療藥物，觀察振脾湯對(duì)TNBS/乙醇致UC大鼠的療效和免疫功能變化。(4)振脾湯應(yīng)用于臨床，觀察治療緩解期UC患者的療效并研究其對(duì)

4、免疫功能的影響。為探討UC發(fā)病的免疫病理?yè)p傷過(guò)程和選擇治療藥物奠定基礎(chǔ)。 第一部分潰瘍性結(jié)腸炎動(dòng)物模型制作 目的：采用TNBS誘導(dǎo)大鼠潰瘍性結(jié)腸炎動(dòng)物模型，探討與人UC的相似程度。 方法：TNBS/乙醇法制作潰瘍性結(jié)腸炎動(dòng)物模型，分別于造模后1周、3周、7周三個(gè)時(shí)間段動(dòng)態(tài)觀察模型鼠的一般狀態(tài)、結(jié)腸粘膜大體和病理及電鏡變化。 結(jié)果 1 一般情況：正常組大鼠大便顆粒狀，肛周潔凈。造模第2天大鼠出現(xiàn)腹瀉

5、，軟便或稀便。2周時(shí)癥狀達(dá)到高峰，膿血便，大便完全為稀便。癥狀持續(xù)3周時(shí)開(kāi)始逐漸好轉(zhuǎn)。第4-7周為微軟顆粒狀大便。 2 大體形態(tài)觀察和損傷評(píng)分：正常組生理鹽水灌腸僅引起結(jié)腸輕微的充血；大鼠模型1組，結(jié)腸粘膜充血水腫、糜爛，潰瘍呈白色線狀或灶狀，其大體形態(tài)損傷評(píng)分為7.35±1.21；模型2組，結(jié)腸粘膜水腫、紅斑、潰瘍，周圍粘膜增厚，其大體形態(tài)損傷評(píng)分為4.51±1.08；模型3組結(jié)腸大體形態(tài)逐漸恢復(fù)正常，潰瘍已愈合，其大體形態(tài)損

6、傷評(píng)分為1.27±0.41，與正常對(duì)照組相比模型組的大體形態(tài)損傷有顯著差異(p<0.01)，各模型組間亦有明顯差異(P<0.05)。 3 光鏡下觀察病理情況：正常組生理鹽水灌腸僅引起結(jié)腸輕微的充血；大鼠模型1組，結(jié)腸粘膜上皮水腫、壞死、脫落，以中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主，組織學(xué)損傷計(jì)分為8.51±1.07；模型2組，可見(jiàn)瘢痕組織，在潰瘍?cè)畋砻嫒钥梢?jiàn)大量炎細(xì)胞，組織學(xué)損傷計(jì)分為6.28±0.87；模型3組表現(xiàn)為慢性炎癥，可見(jiàn)正在愈合的潰瘍

7、，結(jié)締組織增生并纖維化，組織學(xué)損傷計(jì)分為2.47±0.96，與正常對(duì)照組相比模型組的組織學(xué)損傷有顯著差異(p<0.01)，各模型組間亦有明顯差異(P<0.05)。 4 電鏡結(jié)果：1)掃描電鏡：正常組可見(jiàn)結(jié)腸粘膜表面大量吸收細(xì)胞，其表面有大量微絨毛；模型組可見(jiàn)微絨毛縮短和數(shù)目減少或消失，杯狀細(xì)胞減少。2)透射電鏡：正常組結(jié)腸粘膜的吸收細(xì)胞呈高柱狀，核橢圓形，常染色質(zhì)豐富。模型組可見(jiàn)游離面吸收細(xì)胞部分微絨毛減少，細(xì)胞核稍不規(guī)則，細(xì)胞

8、器數(shù)量減少，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有脫顆?，F(xiàn)象。 結(jié)論：三硝基苯磺酸(TNBS)可以成功誘導(dǎo)大鼠潰瘍性結(jié)腸炎動(dòng)物模型，一般情況、大體與病理表現(xiàn)與人UC的相似度高，有急、慢性轉(zhuǎn)變過(guò)程等，而且是免疫學(xué)模型，可用于UC免疫學(xué)方面的研究。 第二部分潰瘍性結(jié)腸炎免疫功能變化的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究 目的：研究TNBS/乙醇致UC大鼠的免疫功能的變化，包括T細(xì)胞亞群、紅細(xì)胞免疫、免疫球蛋白、補(bǔ)體以及炎癥介質(zhì)的變化。 方法 1 采用

9、ELISA檢測(cè)uC大鼠細(xì)胞因子TNF-α、IL-2、IL-4的變化。 2 采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)UC大鼠T細(xì)胞亞群的變化。 3 采用免疫比濁法檢測(cè)UC大鼠血清免疫球蛋白和補(bǔ)體的變化。 4 采用酵母菌花環(huán)法檢測(cè)UC大鼠紅細(xì)胞免疫功能的變化 結(jié)果 1 UC大鼠細(xì)胞因子的變化：結(jié)果表明模型組血清TN-α、IL-2含量在1周、3周、7周三個(gè)時(shí)間段均有顯著升高，與正常組比較有顯著差異(P<0.05)，1周時(shí)表達(dá)

10、最高，3周時(shí)已有明顯下降，7周時(shí)與1周模型組比較有顯著差異(P<0.05)。而血清IL-4含量在1周、7周時(shí)UC大鼠與正常組比較無(wú)顯著差異(P>0.05)，3周時(shí)出現(xiàn)降低，與其它組比較有顯著差異(P<0.05)。 2 UC大鼠T細(xì)胞亞群的變化：結(jié)果表明造模后1周、3周、7周三個(gè)時(shí)間段模型組大鼠外周血CD3<'+>、CD4<'+>細(xì)胞百分比均明顯高于正常組(P<0.05)；而CD8+細(xì)胞百分比較正常組降低(P<0.05)；CD4<

11、'+>/CD8<'+>比值明顯高于正常組(P<0.05)。 3 UC大鼠血清免疫球蛋白和補(bǔ)體的變化：結(jié)果表明造模后1周、3周、7周三個(gè)時(shí)間段模型組大鼠外周血血清免疫球蛋白IgG、IgA均明顯高于正常組(P<0.05)，在造模1周時(shí)表達(dá)最高，3周時(shí)已有下降，7周時(shí)與1周模型組比較已有顯著差異(P<0.05)；IgM與正常組比較無(wú)顯著差異(P>0.05)；而補(bǔ)體C3、C4在三個(gè)時(shí)間段均較正常組降低(P<0.05)。 4 UC

12、大鼠紅細(xì)胞免疫功能的變化：酵母菌花環(huán)法紅細(xì)胞免疫結(jié)果表明造模后1周、3周、7周三個(gè)時(shí)間段模型組RCIC含量均顯著高于正常組(P<0.05)，但其含量在逐漸減少，7周模型鼠已明顯低于1周模型鼠(P<0.05)；而RC3bR在三個(gè)時(shí)段均降低(P<0.05)，其含量在逐漸升高，7周模型鼠已明顯高于1周模型鼠(P<0.05)。 結(jié)論 1 T細(xì)胞亞群CD3<'+>、CD4<'+>、CD4<'+>/CD8<'+>增高，CD8<'+>

13、細(xì)胞比例下降。 2 細(xì)胞因子TNF-α、IL-2含量增高，IL-4含量降低。 3 外周血免疫球蛋白IgG、IgA含量異常增高，補(bǔ)體C3、C4降低。 4 紅細(xì)胞免疫示RCIC升高，RC3bR降低。說(shuō)明存在細(xì)胞和體液免疫功能亢進(jìn)，紅細(xì)胞免疫功能障礙，導(dǎo)致循環(huán)免疫復(fù)合物(CIC)在腸粘膜的沉積，從而引發(fā)腸粘膜局部的變態(tài)反應(yīng)。 第三部分振脾湯對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎免疫功能影響的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究 目的：選取中藥方劑振脾

14、湯為治療藥物，觀察振脾湯對(duì)TNBS/乙醇致UC大鼠的療效并探討其作用機(jī)制。 方法 1 觀察各組大鼠的一般狀態(tài)、結(jié)腸粘膜大體和病理變化。 2 免疫學(xué)檢測(cè)指標(biāo)：(1)ELISA法檢測(cè)血清TNF-α、IL-2、IL-4的變化；(2)采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)uc大鼠T細(xì)胞亞群的變化)；(3)酵母菌花環(huán)法檢測(cè)：RCIC、RC3bR的變化。 結(jié)論 1 治療后細(xì)胞因子TNF-α、IL-2、IL-4和T細(xì)胞亞群CD3<

15、'+>、CD4<'+>、CD8<'+>細(xì)胞百分、CD4<'+>/CD8<'+>比值恢復(fù)至正常水平，說(shuō)明被打破的Th1/Th2平衡得到糾正，機(jī)體細(xì)胞免疫功能亢進(jìn)的情況得到了有效的抑制。 2 治療后紅細(xì)胞免疫結(jié)果示RCIC、RC3bR亦恢復(fù)至正常水平，也進(jìn)一步驗(yàn)證了本中藥對(duì)體液免疫功能亢進(jìn)的糾正能力，組織病理學(xué)顯示病變組織被修復(fù)，粘膜大體形態(tài)恢復(fù)。與UC的經(jīng)典用藥SASP作為對(duì)照研究其機(jī)理，顯示振脾湯在慢性期對(duì)UC的療效優(yōu)于SASP

16、。 第四部分振脾湯對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎緩解期患者的臨床療效觀察 目的：觀察振脾湯治療緩解期UC患者的療效，并研究其對(duì)免疫功能的影響。 方法 1 觀察患者的1年內(nèi)復(fù)發(fā)情況。 2 結(jié)腸鏡主要觀察結(jié)腸粘膜的充血、水腫等。 3 結(jié)腸鏡粘膜活檢觀察粘膜的炎細(xì)胞浸潤(rùn)、腺體排列異常、杯狀細(xì)胞減少等指標(biāo)。 4 免疫比濁法檢測(cè)血清免疫球蛋白IgA、IgG、IgM補(bǔ)體C3、C4。 5 流式檢測(cè)T細(xì)胞

17、亞群CD<,3><'+>、CD<,4><'+>、CD<,8><'+>百分率、CD<,4><'+>/CD<,8><'+>的變化和CD<,19><'+>、CD<,56><'+>百分率。 6 酵母菌花環(huán)法檢測(cè)RCIC、RC3bR的變化。 結(jié)論 1 治療后振脾湯組復(fù)發(fā)率明顯低于SASP組，說(shuō)明振脾湯組遠(yuǎn)期療效優(yōu)于SASP組。 2 結(jié)腸鏡及腸粘膜病理改變證實(shí)治療后兩組結(jié)腸粘膜病理組織學(xué)變化與治療前比較均有不同程度的