兒童急性呼吸道感染病毒病原學(xué)分析.pdf

1、[目的]
　　 1.建立一種能同時(shí)檢測多種呼吸道病毒的多重PCR方法,探討影響多重PCR擴(kuò)增的因素。
　　 2.將建立的多重方法應(yīng)用于檢測臨床兒童呼吸道標(biāo)本,對(duì)多重方法進(jìn)行評(píng)價(jià),使多重方法能夠直接從臨床標(biāo)本中檢測與鑒別相應(yīng)的呼吸道病毒。
　　 3.了解臨床兒童呼吸道病毒感染常見病原體分布情況,采取有針對(duì)性治療措施,避免盲目用藥。對(duì)深圳、粵東地區(qū)兒童常見呼吸道病毒感染進(jìn)行監(jiān)測、分析,并探討其流行規(guī)律。
　　

2、 [方法]
　　 1標(biāo)本采集與處理
　　 依據(jù)病情狀況和臨床表現(xiàn)采用不同的檢測標(biāo)本,對(duì)以上呼吸道癥狀為主要表現(xiàn)的患者,選鼻咽分泌物為檢測標(biāo)本;對(duì)以下呼吸道癥狀為主要表現(xiàn)的患者,首選支氣管肺泡灌洗標(biāo)本,考慮到進(jìn)行支氣管鏡操作具有一定制約因素,選擇痰標(biāo)本進(jìn)行病原學(xué)檢測。
　　 2引物設(shè)計(jì)
　　 通過查閱文獻(xiàn),在GeneBank中分別找到呼吸道合胞病毒(Respiratorysyncytial virus,RS

3、V)、鼻病毒(Rhinovirus,RHV)、流感病毒A型(Influenza virus A,IVA)、流感病毒B型(Influenza virus B,IVB)、副流感病毒1型(Parainfluenza virus1,PIV1)、副流感病毒3型(Parainfluenza Virus3,PIV3)、偏肺病毒(Metapneumovirus,MPV)、腺病毒(Adenovirus,ADV)和博卡病毒(Bocavirus,BOV)9種

4、呼吸道病毒對(duì)應(yīng)的特異基因序列,分析病毒基因組保守區(qū),根據(jù)保守區(qū)基因序列利用Primer5.0和Olig06.0軟件設(shè)計(jì)、評(píng)價(jià)引物。
　　 3多重PCR方法檢測兒童呼吸道常見病毒
　　 優(yōu)化反應(yīng)體系,建立檢測DNA呼吸病毒和RNA呼吸病毒多重PCR篩查體系。陽性產(chǎn)物用測序引物二次擴(kuò)增,經(jīng)測序予以確證。
　　 4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0對(duì)計(jì)數(shù)資料進(jìn)行卡方檢驗(yàn)(X2 test),P＜0.0

5、5為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 [結(jié)果]
　　 1、所設(shè)計(jì)引物Tm值相近,在同一條件下均獲得較好的擴(kuò)增。擴(kuò)增片段大小有差異,能夠用瓊脂糖凝膠電泳的方法區(qū)分開來,引物均只對(duì)預(yù)期的片段進(jìn)行擴(kuò)增。
　　 2、根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),我們主要探討了以下幾個(gè)影響反應(yīng)的因素并進(jìn)行了調(diào)整,包括退火溫度、緩沖液的濃度、酶、引物的濃度等。通過優(yōu)化以上條件,各對(duì)引物對(duì)應(yīng)的條帶可以獲得比較均一的擴(kuò)增。
　　 3、在686例標(biāo)本中病毒陽性3

6、62例(52.77％),其中RSV感染占首位,達(dá)到31.22%(113/362),其次是RHV為16.85%(61/362),最低是IVB占0.83%(3/362),IVA占14.36%(52/362),PIV1和PIV3分別占7.73%(28/362)和8.29%(30/362),ADV達(dá)到9.67%(35/362),而BOV和MPV分別占6.08%(22/362)和4.97%(18/362)。本研究病例中兩種以上病毒感染者達(dá)9.3%

7、(64/686),以RSV、IVA聯(lián)合其他病毒感染為主,最多可見5種病毒合并感染。83例健康兒童對(duì)照組中,檢測出4例RHV和3例RSV,陽性分別為4.82%和3.61%;僅1例PIV3,陽性率為1.20%,其余均為陰性。
　　 4、研究發(fā)現(xiàn),RSV、RHV和IVA是重要的致病原。RSV陽性率分別達(dá)16.47%,經(jīng)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)年齡之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。RHV和IVA陽性率分別達(dá)到8.89%和7.58%,統(tǒng)計(jì)后發(fā)現(xiàn)年齡之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)

8、意義。
　　 5、通過實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果分析,在深圳地區(qū)首先檢出BOV和MPV。
　　 [結(jié)論]
　　 1實(shí)驗(yàn)證明,所建立多重PCR技術(shù)檢測兒童呼吸道標(biāo)本中常見病毒的方法,敏感性、特異性和可重復(fù)性好,為常見呼吸道病毒的檢測提供了一種方便易行的方法。
　　 2 RSV、RHV及IVA是深圳、粵東地區(qū)兒童呼吸道感染的主要病毒病原,混合感染以RSV、IVA聯(lián)合其他病毒感染為主,診治時(shí)應(yīng)根據(jù)所感染病原體制定有針對(duì)性的