粘蟲遷飛型轉(zhuǎn)為居留型的關(guān)鍵時期和調(diào)控基礎(chǔ).pdf

1、本文在前人已有的工作基礎(chǔ)上，應(yīng)用生理、生態(tài)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法，研究確定了粘蟲Mythimnaseparata(Walker)遷飛與生殖的關(guān)鍵時期及其在進(jìn)化上的適應(yīng)意義，明確了可對關(guān)鍵時期起作用的三種環(huán)境因子及其相應(yīng)的作用，確定了保幼激素(JH)釋放量的增加是遷飛個體轉(zhuǎn)化為居留個體的主要原因，克隆和鑒定了對JH具有調(diào)控作用的粘蟲促咽側(cè)體激素(Mytse-AT)基因，并獲得了該基因編碼區(qū)的全序列，明確了Mytse-AT基因的半表達(dá)量和

2、相對表達(dá)量與JH滴度的關(guān)系，得到了對粘蟲具有生物活性即可以對其關(guān)鍵時期起作用的AT重組蛋白，為全面闡明粘蟲的遷飛行為機(jī)制提供了新的科學(xué)依據(jù)，為深化昆蟲遷飛研究的理論與應(yīng)用實(shí)踐開辟了新的途徑。主要的研究結(jié)果如下： 研究確定了粘蟲遷飛個體轉(zhuǎn)化為居留個體的關(guān)鍵時期及其在進(jìn)化適應(yīng)中的意義。以遷飛個體的產(chǎn)卵前期較長飛行能力越強(qiáng)的理論為依據(jù)，對室內(nèi)誘導(dǎo)的遷飛個體羽化后的不同時期進(jìn)行饑餓處理的結(jié)果表明，成蟲羽化后的24-30小時內(nèi)進(jìn)行超過12

3、小時的饑餓，可以使處理成蟲的求偶和產(chǎn)卵前期縮短，產(chǎn)卵量增加，而在其它時間進(jìn)行處理則沒有這種效果。表明成蟲羽化后的24小時是粘蟲遷飛與生殖調(diào)控的關(guān)鍵時期。即在成蟲羽化前的發(fā)育過程中形成的遷飛行為在羽化以后的24小時內(nèi)依然可以改變。但是，同樣的環(huán)境因子對不同發(fā)育階段的居留型成蟲個體則沒能產(chǎn)生相同的影響作用：羽化后24小時處理的成蟲與2、3日齡處理的產(chǎn)卵前期雖然比對照的有所延長，但1-3日齡之間的處理并沒有顯著差異，另外，1日齡處理的產(chǎn)卵量及

4、壽命等與對照的也沒有顯著的差異。這些結(jié)果表明，雖然遷飛個體可以在可操縱因素的影響下向非遷飛個體轉(zhuǎn)變，非遷飛個體轉(zhuǎn)化為遷飛個體的過程可能是不可逆的，因此，遷飛個體要比居留型的生活史彈性要強(qiáng)。這些結(jié)果較好地回答了遷飛種群較非遷飛種群的適應(yīng)能力更強(qiáng)的問題。 研究明確了對關(guān)鍵時期可以起作用的一些環(huán)境因子及相應(yīng)的影響作用。進(jìn)一步就低溫、光照等環(huán)境因子對處于不同發(fā)育階段的遷飛個體進(jìn)行處理的結(jié)果也表明，光照和低溫與饑餓處理一樣，對羽化后24小

5、時內(nèi)的遷飛個體的產(chǎn)卵前期具有影響作用，即可以顯著地縮短成蟲的生殖前期，并使產(chǎn)卵量增加。這樣，低溫和光照處理處理都可以使遷飛個體轉(zhuǎn)變?yōu)樯硞€體，但對羽化24小時以后的成蟲進(jìn)行同樣的處理則對其產(chǎn)卵前期沒有影響，表明處于關(guān)鍵時期的遷飛成蟲個體對于來自不同的環(huán)境生理因子的刺激十分敏感。但是，這些環(huán)境因子的刺激必須要達(dá)到一定的程度才能產(chǎn)生作用：溫度必須在5℃的條件下才能發(fā)生作用，而在10℃和15℃的條件下沒有作用；饑餓則必須大于6小時才會發(fā)生作用

6、，光照只有在24小時長光照的條件下才能發(fā)生作用，而在24小時全黑暗或在短光照的條件下沒有作用。但是，相同強(qiáng)度的低溫和光照對居留型相同時期進(jìn)行的處理則沒能改變其產(chǎn)卵前期或產(chǎn)卵量，即處理與對照的沒有顯著差異。這些結(jié)果的獲得再次表明，居留型個體的生活史彈性或?qū)Νh(huán)境的適應(yīng)能力比遷飛型的要弱，因?yàn)檫w飛個體在羽化后的24小時內(nèi)，如果遇到低溫或找不到補(bǔ)充營養(yǎng)，就可放棄遷飛而留在本地生殖，而其生殖能力不會受到影響，但居留型個體無論環(huán)境條件如何變化，都只

7、能留在本地生殖。這些結(jié)果對于闡明粘蟲遷飛行為的發(fā)生規(guī)律提供了更進(jìn)一步的科學(xué)依據(jù)。 研究明確了JH提前分泌是上述環(huán)境因子使遷飛個體轉(zhuǎn)變?yōu)闇魝€體的主要原因。為了闡明主要環(huán)境因子對關(guān)鍵時期的影響作用機(jī)制，應(yīng)用傳統(tǒng)的研究思路對處理過的1日齡成蟲的卵巢發(fā)育、飛行肌降解程度、飛行能力以及保幼激素的變化規(guī)律進(jìn)行了研究。所獲的結(jié)果表明，經(jīng)饑餓處理的遷飛型初羽化成蟲卵巢發(fā)育速度明顯加快，處理后24-144小時的卵巢發(fā)育級別一直顯著高于對照的；處

8、理成蟲中胸背縱肌重量在處理后的72小時內(nèi)與對照的沒有顯著差異，但在96小時后明顯低于對照的，到120小時后差異達(dá)到顯著水平，表明處理成蟲的飛行肌降解速度顯著加快；處理后24-72小時成蟲的飛行能力沒有顯著差異，但在96-144小時的飛行能力顯著低于對照成蟲的，這與飛行肌降解的水平相一致；經(jīng)饑餓處理后的成蟲二種JH(JHⅠ和JHⅡ)滴度也有較大的差異，JHⅠ在羽化后120小時之間差異不明顯，但到144小時后差異十分明顯。JHⅡ不同日齡之間

9、差異較大，羽化后24h內(nèi)的滴度明顯低于其它日齡。處理后24小時，JHⅡ與對照的即產(chǎn)生明顯的差異，到處理后的120h，差異達(dá)到最大。表明JHⅡ可能是控制粘蟲卵巢和飛行能力的發(fā)育、飛行肌降解的主要內(nèi)分泌調(diào)控因子。這樣，由于已經(jīng)明確粘蟲的卵巢和飛行能力的發(fā)育，以及飛行肌的降解都受JH的調(diào)控，而本文所得的結(jié)果又與已有的研究結(jié)果相一致，因而可以認(rèn)為，遷飛個體的咽側(cè)體(CA)在初羽化時是沒有活性的，但由于饑餓、低溫等環(huán)境因子的刺激，初羽化遷飛個體的

10、咽側(cè)體得到了活化，從而使得JH提前釋放是導(dǎo)致遷飛個體轉(zhuǎn)化為居留個體的主要原因。 研究獲得了對JH釋放具有調(diào)控作用的粘蟲促咽側(cè)體激素(Mytse-AT)基因編碼區(qū)的全序列。雖然上述研究闡明了JH是導(dǎo)致粘蟲遷飛個體轉(zhuǎn)變?yōu)榫恿魝€體的主要內(nèi)分泌因子，但是對粘蟲JH釋放具有調(diào)控作用的因子目前并不清楚。為此，以雌蛾腦cDNA為模板，應(yīng)用分子生物學(xué)方法獲得Mytse-AT基因之后，經(jīng)序列分析確定了編碼區(qū)全長為411bp，編碼區(qū)為136個氨基酸

11、，分子量為15.385KD，等電點(diǎn)為5.245的Mytse-AT基因。成熟的Mytse-AT多肽位于第39至52個氨基酸殘基。其序列和純化的Manse-AT多肽及煙草天蛾的AT基因預(yù)測的氨基酸序列完全相同。該基因與其近源種，一點(diǎn)粘蟲Pseudaleciaunxipunxcta的AT前體蛋白基因的同源性高達(dá)97％。雖然Mytse-AT基因的全部功能并沒有明確，但由于已經(jīng)知道Manse-AT多肽具有促進(jìn)鱗翅目昆蟲分泌JH的作用，再加上前體中

12、成熟的AT多肽的氨基酸序列也與已知的煙草天蛾AT多肽氨基酸序列同源性達(dá)100％，據(jù)此初步認(rèn)為，初羽化的粘蟲遷飛個體的AT以及CA都沒有活化，當(dāng)粘蟲腦受到外界環(huán)境因子的刺激后，Mytse-AT基因表達(dá)的活性物質(zhì)激活了咽側(cè)體，并開始分泌JH，從而使遷飛個體轉(zhuǎn)化為居留個體。但更深層次的機(jī)理依然需要進(jìn)一步的研究。 研究明確了Mytse-AT基因的表達(dá)量與JH滴度的動態(tài)關(guān)系。為了驗(yàn)證Mytse-AT基因在成蟲期的表達(dá)水平是否與JH滴度的變

13、化水平相吻合，應(yīng)用半定量RT-PCR和適時熒光定量PCR對經(jīng)過低溫處理的遷飛個體進(jìn)行了分析。所獲的結(jié)果表明，半定量RT-PCR分析的結(jié)果與JH滴度水平的吻合程度較高，對照成蟲羽化后24h、72h內(nèi)的表達(dá)量極低，羽化后48h略有一些表達(dá)量，大量的表達(dá)則出現(xiàn)在羽化后96-144h之間，而對于經(jīng)過饑餓處理的成蟲而言，相同時間的Mytse-AT表達(dá)量均大于對照的，其中以處理后96h的表達(dá)量最大，第120h減少。用適時熒光定量PCR分析所得的結(jié)果

14、與血淋巴內(nèi)JH以及半定量RT-PCR分析的結(jié)果也比較一致，除了經(jīng)過饑餓處理的成蟲沒有像JH滴度和半定量分析的那樣在羽化后120h出現(xiàn)較大的峰值。Mytse-AT基因的表達(dá)量與JH，尤其是JHⅡ滴度的時序變化相一致的結(jié)果表明，1日齡饑餓對于AT基因的表達(dá)量具有明顯的促進(jìn)作用。綜合分析的結(jié)果說明，在羽化后最初幾天，AI表達(dá)量的變化和JH的滴度基本上是呈正相關(guān)，正是由于AT蛋白量的增加，激活了CA，并使其合成和釋放JH滴度的速度增加，從而使遷

15、飛個體轉(zhuǎn)化為居留型個體。 根據(jù)Mytse-AT基因的序列特征設(shè)計了一對特異性引物，并優(yōu)化了蛋白純化的步驟和方法，獲得了對粘蟲關(guān)鍵時期或?qū)A具有活性或可以提高JH滴度的AT外源重組蛋白。主要的證據(jù)是：AT外源重組蛋白的使用可以顯著地縮短粘蟲遷飛個體的產(chǎn)卵前期，而使用空載體或丙酮處理的成蟲與對照的沒有顯著差異；上述章節(jié)已經(jīng)明確，粘蟲的產(chǎn)卵前期或卵巢發(fā)育的速度均受到JH的調(diào)控，Mytse-AT基因的時序表達(dá)量與JH滴度的動態(tài)關(guān)系緊密