毛葡萄有效部位成分的提取及抗血栓作用的研究.pdf

1、研究目的：分離提取毛葡萄有效部位及對(duì)其提取物的抗血栓形成作用及其機(jī)制進(jìn)行研究，為毛葡萄成藥性研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　實(shí)驗(yàn)方法：（1）毛葡萄有效部位的分離提取及化學(xué)組分鑒定：采用現(xiàn)代中藥分離工藝及液質(zhì)譜分析儀分析有效部位提取物的化學(xué)成分。（2）毛葡萄有效部位提取物對(duì)大鼠血栓形成的影響：用體外動(dòng)靜脈旁路血栓形成的大鼠模型，實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為對(duì)照組（control）：蒸餾水灌胃；毛葡萄有效部位高劑量組（VRE-HD）；毛葡萄有效部位中劑量組

2、（VRE-MD）；毛葡萄有效部位低劑量組（VRE-LD）；阿司匹林組（ASP）。大鼠連續(xù)灌胃3天后用3.6%水合氯醛腹注麻醉，分離大鼠左側(cè)的頸總動(dòng)脈和右側(cè)的頸外靜脈，結(jié)扎頸外靜脈遠(yuǎn)心端，剪開一個(gè)小口，將準(zhǔn)備的體外聚乙烯管的其中一頭向近心端方向插入并結(jié)扎固定。同時(shí)在頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)心端也剪開一個(gè)小口，將管的另一頭向頸總動(dòng)脈近心端插入并結(jié)扎固定。計(jì)時(shí)15min后中斷血流，取出線栓在濾紙上吸干并稱重；隨后放入恒溫干燥箱烘干并稱重。由腹主動(dòng)脈取得的動(dòng)

3、脈血經(jīng)室溫離心后，吸取上清血漿用放射免疫計(jì)數(shù)儀檢測(cè)血漿中的TXB2和6-keto-PGF1α的水平。（3）毛葡萄有效部位對(duì)血小板聚集的影響：實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為對(duì)照組（control）：蒸餾水灌胃；毛葡萄有效部位高劑量組（VRE-HD）；毛葡萄有效部位中劑量組（VRE-MD）；毛葡萄有效部位低劑量組（VRE-LD）；阿司匹林組（ASP）。連續(xù)灌胃3天，末次給藥后60分鐘，采用3.6%水合氯醛腹腔注射麻醉動(dòng)物，由動(dòng)物的的腹主動(dòng)脈取血，離心取出上清

4、液得到富血小板血漿，以ADP和膠原作為誘導(dǎo)劑，用血小板聚集儀測(cè)定同一時(shí)間段對(duì)照組、毛葡萄有效部位中劑量組和阿司匹林組的血小板的最大聚集率。（4）血小板聚集體外實(shí)驗(yàn)：取健康人的外周靜脈血，離心取出上清液得到富血小板血漿（platelet rich plasma， PRP），再向PRP中加入Apyrase和PGE1后，并離心后棄上清液，向剩下的血小板沉淀加入Tyrode’s buffer使其重懸成為洗滌血小板。以collagen，CVX和T

5、hrombin作為誘導(dǎo)劑，用血小板聚集儀測(cè)定同一時(shí)間段毛葡萄有效部位高、中、低劑量組和阿司匹林組的血小板的最大聚集率。（5）數(shù)控剪切流條件下活細(xì)胞分析實(shí)驗(yàn)：將鈣黃綠素加入到大鼠全血和人的全血中，并使其終濃度為4μM，室溫下孵育1 h，再向其中加入毛葡萄有效部位提取物的水溶液混勻孵育10 min。取濃度160 ug/mL的I型膠原溶液20 uL，以5 dyn/cm2的剪切力，進(jìn)入Bioflux微流通道灌注20 s，然后室溫下靜置1 h。將

6、加藥的帶有熒光標(biāo)記的全血加入進(jìn)液A孔，未加藥的帶熒光標(biāo)記的全血加入B孔，作為對(duì)照。每孔50 uL，從進(jìn)液孔施加10 dyn/cm2的剪切力，當(dāng)血栓開始形成膠原蛋白時(shí)，立即用熒光顯微鏡FITC范圍進(jìn)行圖像的采集，以達(dá)到預(yù)期目標(biāo)為準(zhǔn)。
　　結(jié)果：
　?。?）有效部位的分離提取及成分鑒定：毛葡萄有效部位的提取物采用液質(zhì)譜儀分析得出該提取物中主要含有二氫楊梅素，槲皮素和芹菜素這三種成分。
　?。?）對(duì)大鼠血栓形成的影響：與對(duì)照

7、組相比，各毛葡萄藥物組均可以明顯抑制大鼠體內(nèi)血栓形成和顯著地降低血漿中TXB2水平和升高6-keto-PGF1α水平，其中以中劑量組效果尤為明顯，并且其效果要好于陽(yáng)性藥物阿司匹林。
　?。?）對(duì)血小板聚集的影響：實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明毛葡萄有效部位對(duì)由 ADP和膠原誘導(dǎo)的大鼠、小鼠血小板聚集抑制作用明顯，其效果要好于阿司匹林。此外，對(duì)collagen，CVX和Thrombin誘導(dǎo)人血小板聚集也有明顯的抑制作用，而且這種抑制作用呈現(xiàn)出劑量依賴

8、性。活細(xì)胞分析實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示有效部位提取物具有抑制膠原誘導(dǎo)的大鼠和人的血小板粘附聚集的作用。
　　結(jié)論：
　　1、毛葡萄有效部位提取物中主要含有二氫楊梅素，槲皮素和芹菜素這三種成分。
　　2、毛葡萄有效部位提取物具有明顯的抗血栓形成作用，該作用可能與 TXB2和6-keto-PGF1α水平有關(guān)。
　　3、毛葡萄有效部位提取物具有抑制在體 ADP和膠原誘導(dǎo)的血小板聚集的作用和體外collagen，CVX和Throm