靶向IL-1和RANKL的聯(lián)合基因治療磨損顆粒導(dǎo)致的無(wú)菌性假體松動(dòng)的研究.pdf

1、第一部分應(yīng)用IL-1受體阻斷劑和骨保護(hù)素聯(lián)合基因治療無(wú)菌性假體松動(dòng)作用和機(jī)制的體外研究研究背景近年來(lái)隨著人們生活水平的提高,肥胖和老齡化帶來(lái)的一些疾病日益受到重視,比如晚期骨性關(guān)節(jié)炎,該病不僅給患者帶來(lái)痛苦,晚期關(guān)節(jié)畸形使患者喪失行動(dòng)能力,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。伴隨人工關(guān)節(jié)技術(shù)的發(fā)展,關(guān)節(jié)置換手術(shù)對(duì)此難題迎刃而解,成為目前對(duì)嚴(yán)重關(guān)節(jié)系統(tǒng)疾病的常用治療方式。然而關(guān)節(jié)置換手術(shù)術(shù)后十年并發(fā)無(wú)菌性假體松動(dòng)的發(fā)生率高達(dá)34%。無(wú)菌性假體松動(dòng)發(fā)生

2、后需行關(guān)節(jié)翻修手術(shù),因關(guān)節(jié)翻修術(shù)創(chuàng)傷大難度高,不僅給患者帶來(lái)手術(shù)痛苦,也對(duì)實(shí)施手術(shù)的臨床醫(yī)師提出了更高的技術(shù)要求?；谀壳瓣P(guān)節(jié)置換手術(shù)的廣泛開(kāi)展和無(wú)菌性假體松動(dòng)是關(guān)節(jié)置換術(shù)后最常見(jiàn)的并發(fā)癥,越來(lái)越多的研究也在聚焦對(duì)無(wú)菌性假體松動(dòng)的干預(yù)和治療。因關(guān)節(jié)特殊的解剖構(gòu)造,通常全身用藥往往很難維持關(guān)節(jié)周?chē)^高的藥物濃度,通過(guò)關(guān)節(jié)腔注射往往又對(duì)無(wú)菌性操作有很高的要求,而且該操作為有創(chuàng)操作,給病人帶來(lái)較大的痛苦,且無(wú)菌性假體松動(dòng)是一個(gè)慢性進(jìn)行性發(fā)展的

3、疾病,治療周期較長(zhǎng),病人常難以耐受數(shù)年的治療。如何采取一種給藥方式,能長(zhǎng)期高效的維持局部的藥物濃度,又不至于引起全身血藥濃度的升高,引起不良反應(yīng)。基因治療提供了一個(gè)很好的方法,通過(guò)對(duì)關(guān)節(jié)周?chē)M織的基因轉(zhuǎn)染,使局部組織能持續(xù)高效表達(dá)治療基因,從而達(dá)到持久高效維持局部藥物濃度的目的。無(wú)菌性假體松動(dòng)的病理過(guò)程復(fù)雜,具體發(fā)生機(jī)制尚未完全闡明,但大部分研究表明假體周?chē)鷻C(jī)械磨損產(chǎn)生的生物顆粒在無(wú)菌性假體松動(dòng)的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的作用。關(guān)節(jié)假體因機(jī)

4、械活動(dòng)中產(chǎn)生磨損顆粒,磨損顆粒一方面本身作為異物刺激機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng),另一方面磨損顆粒也會(huì)對(duì)其周?chē)能浗M織的產(chǎn)生機(jī)械性損傷,受傷的組織也會(huì)誘發(fā)局部的炎癥反應(yīng)。因局部炎癥反應(yīng)釋放IL-1、TNF等大量炎癥介質(zhì),導(dǎo)致巨噬細(xì)胞活化并一步釋放大量炎癥介質(zhì),一方面活化的巨噬細(xì)胞加強(qiáng)對(duì)磨損顆粒異物的吞噬,然而人工關(guān)節(jié)常為金屬材料、高分子材料和陶瓷材料,這些材質(zhì)的磨損顆粒在被巨噬細(xì)胞吞噬后往往不能被消化,殘留的磨損顆粒繼續(xù)誘發(fā)炎癥的惡化,另一方面炎癥

5、因子促使大量破骨細(xì)胞生成,造成假體周?chē)侨芙獾募又?進(jìn)一步導(dǎo)致了假體松動(dòng)的發(fā)生,隨著假體松動(dòng)的加重,假體與骨組織的機(jī)械磨損進(jìn)一步加重,產(chǎn)生更多的磨損顆粒,磨損顆粒誘發(fā)更嚴(yán)重的炎癥和骨溶解。綜上所述,整個(gè)病理過(guò)程呈現(xiàn)一個(gè)惡性循環(huán)?；诖宋覀兲岢黾僬f(shuō)：炎癥和骨溶解在無(wú)菌性假體松動(dòng)的發(fā)生發(fā)展中既是-個(gè)相互聯(lián)系又是一個(gè)相互區(qū)別的過(guò)程。根據(jù)這個(gè)假說(shuō)我們提出聯(lián)合應(yīng)用IL-1受體阻斷劑和骨保護(hù)素(OPG)基因治療無(wú)菌性假體松動(dòng)并初步探討無(wú)菌性假體松動(dòng)

6、的病理發(fā)生機(jī)制。目的通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)聯(lián)合應(yīng)用IL-1受體阻斷劑和骨保護(hù)素(OPG)基因治療抑制RAW細(xì)胞活化：一是研究聯(lián)合應(yīng)用抗炎和抗骨溶解對(duì)無(wú)菌性假體松動(dòng)治療的可行性,二是觀察兩者是否具有協(xié)同效果,是否優(yōu)于相同劑量的單獨(dú)治療組,三是進(jìn)一步探討無(wú)菌性假體松動(dòng)病理發(fā)生機(jī)制材料與方法1.細(xì)胞培養(yǎng)活化及基因轉(zhuǎn)染采用RAW264.7細(xì)胞株,將RAW細(xì)胞(2×104/m1)與鈦顆粒懸浮液(1×106/m1)于37℃,5%C02培養(yǎng)箱共同培養(yǎng)(其中鈦顆

7、粒大小為2.3±0.618μ m,與關(guān)節(jié)假體松動(dòng)后磨損顆粒大小相當(dāng)),共同培養(yǎng)72小時(shí)后被隨機(jī)分為5組：第一組為IL-1受體阻斷劑單基因治療組,在分組后立即轉(zhuǎn)染800μl濃度為1×107pfu的編碼IL-1受體阻斷劑基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒液；第二組為OPG單基因治療組,轉(zhuǎn)染濃度為107particles/ml編碼OPG的腺相關(guān)病毒液,其轉(zhuǎn)染時(shí)間為編碼IL-1受體阻斷劑的病毒轉(zhuǎn)染后第3天,第三組為聯(lián)合基因治療組,其轉(zhuǎn)染半劑量的編碼IL-1受體阻

8、斷劑基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒和編碼骨保護(hù)素(OPG)的腺相關(guān)病毒；第四組為L(zhǎng)acZ轉(zhuǎn)染對(duì)照組,轉(zhuǎn)染10’particles/ml編碼LacZ的腺相關(guān)病毒液；第五組為空白對(duì)照組,無(wú)任何病毒轉(zhuǎn)染。為提高聯(lián)合基因的治療時(shí)間,使retrovirus-IL-1Ra和AAV-OPG的基因表達(dá)達(dá)峰時(shí)間重疊,我們分別通過(guò)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了retrovirus-IL-1Ra和AAV-OPG的轉(zhuǎn)染效率,確定了在retrovirus-IL-1Ra轉(zhuǎn)染后3天再轉(zhuǎn)染AAV-OP

9、G,每2天更換一次培養(yǎng)液,將各組每周的上清液收集在一起,經(jīng)過(guò)總共4周的培養(yǎng)將細(xì)胞收獲。2.酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)炎癥介質(zhì)IL-1在完成上述基因轉(zhuǎn)染后,各實(shí)驗(yàn)組每周收取的上清液通過(guò)ELISA試劑盒進(jìn)行檢測(cè)炎癥因子IL-1的釋放量,利用紫外分光光度計(jì)在405nm波長(zhǎng)處讀出吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組IL-1的濃度。3.抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色染色檢測(cè)破骨細(xì)胞RAW細(xì)胞經(jīng)過(guò)基因轉(zhuǎn)染和4周的培養(yǎng)收獲,應(yīng)

10、用TRAP試劑盒對(duì)各治療組進(jìn)行TRAP染色,將濃度為1×106/ML的200μ l各基因轉(zhuǎn)染組RAW細(xì)胞液被甩到組織片上,將片子浸在acetone中固定30秒,片子然后在在0.1M acetate buffer (pH5.2),包含0.5mM naphthol AS-BI phosphoric acid,2.2mM FastGarnet GBC,和lOmM sodium37℃孵育1h,經(jīng)去離子水沖洗后停止反應(yīng)封片。4. Real Tim

11、e-PCR檢測(cè)IL-1、RANK、TRAF6、JNK1、c-Fos、CPK基因的表達(dá)將基因轉(zhuǎn)染后各實(shí)驗(yàn)組RAW細(xì)胞的RNA用TRIZOL試劑進(jìn)行提取,逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中cDNA獲取,從0.5mg的總RNA在40ml的反應(yīng)混合液中進(jìn)行反應(yīng),混合液包含1X PCR buffer,500mM的nucleotide triphosphates,0.5Uml-1o的ribonuclease inhibitor,2.5mM的random hexamers

12、,5.5mM的MgCl2,和1.25Uml-1的reverse transcriptase。反應(yīng)混合液按DNA在25℃作用10min,48℃作用5min,接下來(lái)95℃作用5min的模式下循環(huán).應(yīng)用ABI Prism7700機(jī)器對(duì)炎癥因子IL-lb和信號(hào)分子RANK, c-Fos, TRAF6, JNK1,和CPK進(jìn)行基因表達(dá)的檢測(cè)5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS軟件對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行T檢驗(yàn)或方差分析多重比較,P<；0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)

13、果1.聯(lián)合基因治療的抗炎效果RAW264.7細(xì)胞(2×104)在體外與鈦顆粒懸浮液(1×106)共同培養(yǎng),然后用DFG-IL-1Ra-neo和AAV-GFP-OPG分別或聯(lián)合轉(zhuǎn)染,其中聯(lián)合基因治療組相比于單基因治療組采用半劑量(0.4×104pfu)轉(zhuǎn)染。107particles M-1的AAV-LacZ作為基因治療對(duì)照組。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)表明IL-1Ra基因治療組和聯(lián)合基因治療組在第一周就表現(xiàn)抑制IL-1的釋放,并且3周

14、各治療組均持續(xù)抑制IL-1釋放,但后期OPG治療組抑制效果稍差。4周培養(yǎng)獲取的RAW細(xì)胞經(jīng)RT-PCR檢測(cè)明顯降低了IL-1B的基因表達(dá),且聯(lián)合基因治療組效果最佳。2.聯(lián)合基因治療在破骨細(xì)胞分化中的作用4周培養(yǎng)后獲取的RAW細(xì)胞經(jīng)酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色,OPG和聯(lián)合基因治療組中TRAP陽(yáng)性細(xì)胞明顯減少,IL-1Ra治療組效果稍差。雖然RAW264.7細(xì)胞系中多核細(xì)胞相對(duì)少,但TRAP染色的特性提示了破骨細(xì)胞分化成熟。RT-PC

15、R也表明聯(lián)合基因治療組明顯較低了RANK基因表達(dá),暗示聯(lián)合基因治療具有良好的協(xié)同效果。3.基因治療對(duì)破骨細(xì)胞分化中分子機(jī)制探討應(yīng)用RT-PCR對(duì)破骨細(xì)胞分化中信號(hào)分子進(jìn)行檢測(cè),以LacZ為對(duì)照基準(zhǔn),在IL-Ra、OPG.聯(lián)合基因治療組中cFos分別降低了54%、67%、88%；TRAF6分別降低了25%、31%、44%；在聯(lián)合基因治療組和IL-1Ra組JNK1分別降低了20%、16%；OPG組變化不明顯。聯(lián)合基因治療組CPK降低超過(guò)50

16、%,相對(duì)單基因治療組顯示更好的效果。結(jié)論1. IL-1Ra和OPG聯(lián)合基因治療能有效抗炎,抑制炎癥因子IL-1的釋放。2. IL-1Ra和OPG聯(lián)合基因治療能明顯抑制了破骨細(xì)胞分化。3. IL-1Ra和OPG聯(lián)合基因治療相比于單基因治療組有更好的效果,提示兩者有協(xié)同作用。第二部分利用無(wú)菌性假體松動(dòng)小鼠模型對(duì)IL-1受體阻斷劑和骨保護(hù)素聯(lián)合基因治療的研究研究背景無(wú)菌性假體松動(dòng)作為關(guān)節(jié)置換術(shù)后最常見(jiàn)的遠(yuǎn)期并發(fā)癥,有文獻(xiàn)報(bào)告高達(dá)34%關(guān)節(jié)置換

17、術(shù)后病人會(huì)發(fā)生無(wú)菌性假體松動(dòng)。一旦發(fā)生假體松動(dòng),不僅給患者帶來(lái)肉體上的疼痛,而且病情隨著負(fù)重活動(dòng)增加呈進(jìn)行加重,最終會(huì)導(dǎo)致再次喪失行走能力。目前主要的治療手段就是行關(guān)節(jié)翻修手術(shù),因手術(shù)復(fù)雜、操作困難、費(fèi)用高等局限,探求一種新的治療方案來(lái)延緩或阻止無(wú)菌性假體松動(dòng)的發(fā)生成為研究熱點(diǎn)。在研究無(wú)菌性假體松動(dòng)的過(guò)程中,選擇和建立一種合適的動(dòng)物模型成為重要內(nèi)容。有文獻(xiàn)報(bào)告選擇狗、馬、羊等大型動(dòng)物用于模型創(chuàng)建,該模型優(yōu)點(diǎn)在于：與人類關(guān)節(jié)尺寸類似,而且

18、適合長(zhǎng)期研究,缺點(diǎn)是：研究費(fèi)用高,不易飼養(yǎng),樣本含量受限。也有采用air pounch小鼠模型模擬關(guān)節(jié)內(nèi)環(huán)境,操作方便,但僅適于短期研究,且屬于急性期損失病理變化。本研究項(xiàng)目前期通過(guò)對(duì)小鼠膝關(guān)節(jié)植入鈦釘,并定期注射鈦顆粒,成功創(chuàng)建了無(wú)菌性假體松動(dòng)的小鼠模型,既解決了樣本含量的受限,也適于長(zhǎng)期研究的應(yīng)用。無(wú)菌性假體松動(dòng)的病理機(jī)制復(fù)雜,組織學(xué)顯示假體周?chē)Ｓ醒仔詡文ば纬?大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和假體周?chē)侨芙獍l(fā)生。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為假體磨損產(chǎn)生的顆粒是

19、導(dǎo)致假體周?chē)侨芙?是人工關(guān)節(jié)晚期松動(dòng)的主要原因。由于機(jī)械磨損產(chǎn)生的顆粒作為異物刺激局部發(fā)生炎癥反應(yīng),活化巨噬細(xì)胞,釋放大量IL-1、TNF、IL-6等炎癥因子,炎癥囚子進(jìn)一步刺激成骨細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞等上調(diào)核激活因子KB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor NF-KB ligand, RANKL)的表達(dá)。近年研究發(fā)現(xiàn),OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)在骨組織代謝平衡中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)

20、作用。RANKL與破骨細(xì)胞前體細(xì)胞表明RANK結(jié)合后,就會(huì)啟動(dòng)破骨細(xì)胞的分化生成,加重了局部骨溶解,骨保護(hù)素(OPG)可與RANKL競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合RANK,但不激活破骨細(xì)胞生成,從而起到骨保護(hù)的作用,成為目前破骨細(xì)胞研究中應(yīng)用較多的靶蛋白。在假體-骨界面的炎癥修復(fù)過(guò)程中,肉芽組織大量形成并纖維化,使假體-骨界面之間形成一層偽膜,骨丟失與炎性偽膜的形成進(jìn)一步加重了假體的松動(dòng),產(chǎn)生更多的磨損顆粒,使無(wú)菌炎癥和骨溶解加重形成惡性循環(huán)。本研究早期已

21、經(jīng)充分認(rèn)識(shí)到在無(wú)菌性假體松動(dòng)發(fā)生發(fā)展過(guò)程中,炎癥和骨溶解既相互區(qū)別又相互聯(lián)系的病理過(guò)程。通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證明了應(yīng)有IL-1受體阻斷劑和OPG聯(lián)合基因抑制炎癥和破骨細(xì)胞生成的有效性,為探討在體內(nèi)復(fù)雜內(nèi)環(huán)境下的聯(lián)合抗炎和抗骨溶解的效果,進(jìn)行了在小鼠無(wú)菌性假體松動(dòng)模型上對(duì)IL-1受體阻斷劑和OPG聯(lián)合基因治療的應(yīng)用研究。目的1.建立適于長(zhǎng)期研究無(wú)菌性假體松動(dòng)的小鼠模型2.觀察無(wú)菌假體松動(dòng)的病理變化3.在無(wú)菌性假體動(dòng)物模型復(fù)雜的內(nèi)環(huán)境下應(yīng)用IL-1

22、受體阻斷劑和骨保護(hù)素聯(lián)合基因治療,探討聯(lián)合抗炎和抗骨溶解的治療效果和可行性。材料與方法1.小鼠無(wú)菌性假體松動(dòng)模型的創(chuàng)建及基因轉(zhuǎn)染24只10-12周BALB/c小鼠,實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前小鼠隔離2周,腹小鼠麻醉后無(wú)菌在無(wú)菌條件下,沿右髕韌帶內(nèi)側(cè)做縱行切口,顯露脛骨平臺(tái),刮除脛骨平臺(tái)軟骨,用直徑0.7mm的鉆頭從脛骨平臺(tái)中央垂直鉆入約5mm,準(zhǔn)備植入鈦釘,在植入鈦釘之前向脛骨髓腔注入10μ L鈦顆粒懸浮液,術(shù)后立即進(jìn)行X線拍片確定植入鈦釘位置正確。術(shù)

23、后每4周注射20μL鈦顆粒懸浮液至關(guān)節(jié)腔。術(shù)后第3周隨著無(wú)菌性假體松動(dòng)發(fā)生隨機(jī)分為4組,分別為IL-1Ra治療組(6只),OPG治療組(6只),聯(lián)合基因治療組(6只),LacZ對(duì)照組(6只)。將50μL和25μL含有DFG-IL-IRa的無(wú)菌培養(yǎng)液分別注入IL-1Ra治療組。3天后將將50μL和125μ L含有AAC-OPG的無(wú)菌培養(yǎng)液分別注入OPG治療組和聯(lián)合基因治療組,同時(shí)將50u L含有AAV-LacZ的無(wú)菌培養(yǎng)液注入LacZ對(duì)照

24、組。基因治療8周后處死小鼠,進(jìn)行生物力學(xué)、組織學(xué)檢測(cè)和Micro-CT掃描2. Micro-CT掃描所有小鼠在術(shù)后1周麻醉后行Micro-CT掃描確認(rèn)鈦釘位置良好,基因治療8周后再次性Micro-CT掃描,應(yīng)用MicroCT自帶軟件進(jìn)行脛骨近端鈦釘植入?yún)^(qū)進(jìn)行三維重建,并計(jì)算獲取骨密度,骨容積/總?cè)莘e值。3.小鼠脛骨近端植入物生物力學(xué)檢測(cè)基因治療后8周處死小鼠,從假體關(guān)節(jié)處行膝關(guān)節(jié)離斷,去除假體周?chē)能浗M織顯露鈦釘帽,將假體及脛骨通過(guò)牙科

25、粉置于固定架上,假體釘帽置于固定架的夾持刀片中間,將固定架連接BOSE電子力學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)并進(jìn)行牽拉,對(duì)輸出的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。4.組織學(xué)檢測(cè)拔釘實(shí)驗(yàn)后收集脛骨近端的組織。應(yīng)用福爾馬林緩沖液固定,12%EDTA脫鈣,石蠟包埋。蘇木精.伊紅(HE)染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察新生骨或者骨質(zhì)破壞,并使用Image-Pro軟件測(cè)量假體和脛骨之間偽膜的厚度。5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS軟件包對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)或方差分析及多重比較。p<；0.05表示

26、具有顯著性差異。所有數(shù)值均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。結(jié)果1. Micro-CT掃描基因治療8周后采用Scanco Micro-CT系統(tǒng)對(duì)所有小鼠進(jìn)行骨掃描,三維重建顯示假體周?chē)侨芙庠诼?lián)合基因治療組明顯減少。通過(guò)對(duì)骨密度和骨容積/總?cè)莘e比值的統(tǒng)計(jì),治療組相對(duì)于LacZ對(duì)照組均顯示明顯的治療效果。2.聯(lián)合基因治療組對(duì)脛骨近端植入物機(jī)械力學(xué)檢測(cè)因?yàn)榧袤w周?chē)侨芙獾陌l(fā)生會(huì)導(dǎo)致假體生物力學(xué)穩(wěn)定性變差,因此基因治療8周后,應(yīng)用拔釘實(shí)驗(yàn)檢測(cè)脛骨近端植入

27、鈦釘?shù)姆€(wěn)定性。其中拔釘力線波峰代表鈦釘從脛骨中被拔出一瞬間的力。雖然OPG治療組數(shù)據(jù)波動(dòng)較大,但仍顯示良好的穩(wěn)定性。相對(duì)于LacZ對(duì)照組,雙基因治療組顯示明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而IL-1Ra治療組相對(duì)于LacZ對(duì)照組,雖有不同但并未顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(P=0.21)3.聯(lián)合基因治療組對(duì)骨重建的影響.脛骨近端切片HE組織染色,AAV-LacZ對(duì)照組可以觀察到假體骨界面的偽膜明顯較厚,而各治療組的假膜組織較薄,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<；0.05)