Ghrelin、Obestatin在慢性心衰中的作用及機制研究.pdf

1、慢性心力衰竭是所有心血管疾病的終末狀態(tài)，發(fā)病率逐年上升，目前慢性心衰已成為心血管疾病死亡的最主要原因。重度心衰(NYHAⅣ)患者年病死率甚至可達到40％～50％。多種神經(jīng)體液因素對心衰左室重構(gòu)起調(diào)節(jié)作用，并對發(fā)展預(yù)后起到至關(guān)重要的作用，進一步研究這些血管活性物質(zhì)的功能及作用機制已成為近年來新發(fā)展的一個學科分支心血管內(nèi)分泌學(cardiovascular endocrinology)的重要研究內(nèi)容。
　　 Ghrelin與obes

2、tatin是近年來發(fā)現(xiàn)的～組同源多肽激素。已知ghrelin是生長激素促泌素受體(GHSR)的天然配體，已有一系列研究證實了ghrelin的促進食欲、能量調(diào)節(jié)。心血管系統(tǒng)自身亦可合成和分泌ghrelin，且其受體GHSR亦廣泛分布于心血管系統(tǒng)，提示ghrelin在心血管系統(tǒng)中還可能具有旁分泌/自分泌功能，從而發(fā)揮相應(yīng)的生物學效應(yīng)。研究提示ghrelin可能是一個保護因子：①抑制冠狀動脈粥樣硬化的炎癥反應(yīng)；②保護血管內(nèi)皮細胞功能失調(diào)，抑制

3、內(nèi)皮細胞凋亡；③擴張冠狀動脈，增加心肌供血；④保護缺血及缺血再灌注引起的心肌損傷；⑤拈抗有害物質(zhì)對心肌的損傷，刺激心肌細胞增殖以及抑制心肌細胞的凋亡；⑥抑制血管及血管平滑肌細胞的鈣化；⑦拮抗心梗后交感神經(jīng)活性、早期改善心肌重構(gòu)、改善慢性心衰心功能及臨床癥狀等作用。
　　 Zhang等推測并證實了ghrelin前多肽原還可產(chǎn)生另外一種多肽，并命名為obestatin。這一同源多肽obestatin的功能尚不明確，對其在能量代謝、食

4、欲調(diào)節(jié)等方面的功能及GPR39是否是其受體一直存在爭議。而近期部分研究顯示obestatin具有促進胰島細胞、視網(wǎng)膜上皮細胞增值，抑制精氨酸加壓素分泌等活性。當前關(guān)于Obestatin是否具有心血管活性，obestatin與ghrelin的關(guān)系及二者功能的協(xié)調(diào)與心衰、心源性惡液質(zhì)發(fā)展中交互作用和機制值得進一步研究。因此，本研究擬從以下幾個方面探討在慢性心衰及其常見病因心肌梗死后發(fā)展過程中g(shù)hrelin和obestatin水平變化及其作用

5、；研究ghrelin和obestatin對代謝關(guān)鍵酶AMPK的作用，并初步探討其中機制，以期為目前相關(guān)問題的解決提供一些新的可能思路。1、慢性心衰患者，包括慢性心衰合并惡液質(zhì)患者空腹外周血obestatin水平的變化及其與ghrelin的關(guān)系。2、ghrelin和obestatin對H9C2、原代培養(yǎng)的大鼠心肌細胞的增殖、凋亡的影響，及對AMPK信號通路活化的作用。3、大鼠心梗后至至心衰階段不同時間點外周血ghrelin、obestat

6、in水平的變化及關(guān)系；obestatin注射對心衰大鼠心功能及體重影響。
　　 第一部分：慢性心衰患者外周血ghrelin、obestatin水平變化及意義
　　 目的：探討慢性心衰患者，包括慢性心衰合并惡液質(zhì)患者空腹外周血obestatin水平的變化及其與ghrelin的關(guān)系。
　　 方法：采用RIA法檢測65例慢性心衰患者(心源性惡液質(zhì)患者22例)和15例正常對照者空腹外周血ghrelin、obestatin

7、水平；同時采用RIA法檢測腦鈉肽(BNP)水平，并監(jiān)測體重指數(shù)、血糖、血脂、白細胞、肝腎功能及左室射血分數(shù)(LVEF)。
　　 結(jié)果：慢性心衰合并心源性惡液質(zhì)患者空腹外周血ghrelin水平(1237.8±47.9pg/ml)明顯高于非惡液質(zhì)心衰患者(985.5±64.2 pg/ml，P=0.041)和正常對照(796.4±50.8 pg/ml，P＜0.01)。obestatin水平與ghrelin水平為正相關(guān)，在惡液質(zhì)患者中o

8、bestatin(282.3±13.0 pg/ml)顯著高于非惡液質(zhì)心衰者(163.1±9.2 pg/ml)及正常對照組(161.5±11.8 pg/ml，均P＜0.01)。但ghrelin/obestatin比值卻明顯低于正常對照組(4.5±0.2 vs6.3±0.3，P＜0.01)。相關(guān)分析顯示空腹ghrelin/obestatin比值(coefficient=-1.934，P=0.002)與ghrelin(coefficient=

9、0.01，P＜0.001)是惡液質(zhì)發(fā)展的獨立預(yù)測因素。而與年齡，性別，BNP水平，左室射血分數(shù)(LVEF)，血肌酐水平等其它指標間相關(guān)性無統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)論：慢性心衰合并心源性惡液質(zhì)患者ghrelin和obestatin水平均升高，但ghrelin/obestain比值下降，ghrelin和ghrelin/obestatin比值是惡液質(zhì)發(fā)生的獨立預(yù)測因素。慢性心衰尤其是進展至惡液質(zhì)階段時存在明顯的循環(huán)ghrelin和obe

10、statin紊亂，外周血ghrelin、obestatin比例失衡可能參與慢性心衰尤其是心衰合并惡液質(zhì)的病理生理進程。
　　 第二部分：Ghrelin、Obstatin對心肌細胞增殖/凋亡的作用及AMPK活化的調(diào)節(jié)關(guān)系
　　 目的：觀察ghrelin和obestatin對H9C2、原代培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞的作用：①obestatin對心肌細胞增殖、凋亡和ATP產(chǎn)生的影響；②ghrelin和obestatin對AMPK信號通

11、路活化的作用；并利用無GHSRla表達的H9C2細胞進一步了解AMPK信號通路活化與GHSRla受體之間的關(guān)聯(lián)。③了解ghrelin、obestatin對AngⅡ誘導(dǎo)的心肌肥厚的協(xié)同/拮抗作用。
　　 方法：MTT法檢測不同濃度(10-6～10-8mol/l)的ghrelin和obestatin12小時、24小時、48小時干預(yù)的H9C2細胞株增殖情況；Cell Titer-Glo Luminescent熒光試劑盒檢測ghreli

12、n和obesatin干預(yù)后48h后細胞內(nèi)ATP水平的變化；westem blot檢測obesatin和ghrelin干預(yù)原代心肌細胞0～4小時P-AMPK水平變化；Annexin V-FITC檢測體外培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞10-6mol/l的ghrelin和obestatin對阿霉素誘導(dǎo)凋亡的影響，并加入信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制劑Compound C(AMPK抑制物)檢測P-AMPK在ghrelin抗細胞凋亡過程中的作用；應(yīng)用10-6mol/l的g

13、hrelin、obestatin與血管緊張素(AngⅡ)分別及聯(lián)合干預(yù)原代心肌細胞，檢測0～4小時內(nèi)P-AMPK水平變化，細胞內(nèi)ATP濃度、RT-PCR檢測Anf和β-MHCmRNA變化。
　　 結(jié)論：Obestatin對心肌細胞增殖、凋亡過程無明顯作用。ghrelin促進H9C2細胞增殖，增加原代培養(yǎng)心肌細胞的P-AMPK水平，并可通過AMPK通路抑制心肌細胞凋亡。Ghrelin短暫并部分拮抗AngⅡ?qū)-AMPK的抑制作用，

14、但對AngⅡ的ATP濃度調(diào)節(jié)及促心肌肥大蛋白合成過程無明顯影響；ghrelin對無GHSR1a受體表達的H9C2細胞P-AMPK水平無影響。提示ghrelin對AMPK這一重要能量代謝因子的調(diào)節(jié)與GHSR1a有關(guān)。
　　 第三部分：前降支結(jié)扎心梗大鼠外周血ghrelin、obestatin水平變化及意義
　　 目的：檢測前降支結(jié)扎心梗大鼠外周血ghrelin、obestatin水平的變化及關(guān)系；心梗至心衰后大鼠obest

15、atin注射2周后對大鼠心功能及體重影響。
　　 方法：建立經(jīng)前降支結(jié)扎至心肌梗死后心衰模型(n=12)，假手術(shù)組(n=6)。心衰經(jīng)超聲證實。檢測術(shù)前及術(shù)后到心衰(n=6)不同時間點血漿ghrelin、obestatin水平。心衰大鼠分為obestatin(100ug/Kg)注射組(n=6)和生理鹽水對照組(等量鹽水)(n=6)，在obstatin注射2周后用超聲檢測大鼠左室舒張末直徑(LVEDD)、左室收縮末直徑(LVESD)

16、、左室舒張末容積(LVEDV)、左室收縮末容積(LVESV)、左室射血分數(shù)(EF)、縮短率(FS)變化。
　　 結(jié)論：血漿Obstatin水平在大鼠心梗后24小時明顯降低，3天到4周持續(xù)明顯增加。血漿ghrelin水平在心梗后24小時也明顯降低，以后逐漸升高，心梗4周后才明顯增高。ghrelin/obestatin比值在心梗24小時明顯升高，以后逐漸降低，直到心梗2周后明顯降低。給心衰大鼠注射Obstatin并不能改善心功能。提