豬肝臟組織中l(wèi)incRNA的分子進(jìn)化和甲基化模式研究.pdf

1、豬是重要的家養(yǎng)動(dòng)物，是我國(guó)肉類(lèi)蛋白的主要來(lái)源，其馴化始于大約一萬(wàn)年前，在馴化及品種分化過(guò)程中，為了適應(yīng)復(fù)雜的生態(tài)環(huán)境、人類(lèi)需求及選擇方式形成了豐富多樣的地方豬種，這些豬種的形態(tài)、生理和行為等特征存在較大的差異。近年來(lái)長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）調(diào)控作為一種獨(dú)特的調(diào)控機(jī)制逐漸成為研究的熱點(diǎn)，越來(lái)越多的研究表明lncRNA與哺乳動(dòng)物性狀密切相關(guān)，如lncRNA H19具有調(diào)節(jié)機(jī)體生長(zhǎng)和肌肉發(fā)育的作用。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的

2、lncRNA被鑒定，但是豬的lncRNA數(shù)據(jù)庫(kù)還不完善，豬lncRNA的功能研究少之又少。本研究利用恩施黑豬(ES)、大白豬(LW)和貴州野豬(GZWB)肝臟組織的RNA-seq數(shù)據(jù)鑒定肝臟中的基因間長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lincRNA)，對(duì)豬的lncRNA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行進(jìn)一步完善，并結(jié)合上述三個(gè)樣本的肝臟甲基化組數(shù)據(jù)、已經(jīng)發(fā)表的lincRNA數(shù)據(jù)及中國(guó)家野豬和歐洲家野豬的重測(cè)序數(shù)據(jù)，對(duì)lincRNA的分子特征、甲基化模式、表達(dá)模式、人工選擇下

3、的分子進(jìn)化模式進(jìn)行分析。此外，對(duì)重要的印記lncRNA H19進(jìn)行詳細(xì)的分子進(jìn)化和甲基化模式分析，主要研究結(jié)果如下:
　　(1)通過(guò)對(duì)clean后的恩施黑豬、大白豬和貴州野豬的肝臟組織的RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行Tophat比對(duì)、cufflink組裝、cuffmerge去冗余及過(guò)濾，最終得到861條轉(zhuǎn)錄本，對(duì)應(yīng)于713個(gè)lincRNA基因，其中有403個(gè)lincRNA與目前已經(jīng)鑒定的lncRNA基因和注釋的蛋白編碼基因沒(méi)有重疊，是我們

4、新鑒定的lincRNA;結(jié)合已經(jīng)鑒定的lincRNA及我們鑒定的lincRNA，對(duì)其上下游10kb區(qū)域的編碼基因（潛在靶基因）的生物學(xué)功能進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)這些lincRNA的潛在靶基因主要參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、物質(zhì)代謝和肌細(xì)胞分化。
　　(2)利用RNA-seq數(shù)據(jù)對(duì)lincRNA的表達(dá)模式進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)全基因組水平上，lincRNA的表達(dá)水平顯著低于蛋白編碼基因的表達(dá)水平， ES、LW和GZWB肝臟組織中全部lincRNA的表達(dá)水平?jīng)]有顯

5、著的差異，對(duì)不同組織之間全部lincRNA的表達(dá)水平進(jìn)行比較得出同樣的結(jié)果。
　　(3)通過(guò)差異表達(dá)分析共發(fā)現(xiàn)72個(gè)lincRNA在三個(gè)品種豬的肝臟組織中差異表達(dá)，占總差異表達(dá)lincRNA的12.2％，其中有40個(gè)lincRNA是肝臟組織中特異表達(dá)的;對(duì)差異表達(dá)lincRNA的潛在靶基因的生物學(xué)功能進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)潛在靶基因可能在物質(zhì)代謝、細(xì)胞增殖等生物學(xué)過(guò)程中起重要作用。
　　(4)利用三個(gè)豬種肝臟組織的BS-seq數(shù)據(jù)對(duì)

6、lincRNA的甲基化模式進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)lincRNA不同功能區(qū)域的甲基化水平由高到低依次是內(nèi)含子、外顯子、轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)(TTS)下游2kb、啟動(dòng)子，其中在啟動(dòng)子區(qū)和TTS下游2kb區(qū)lincRNA的甲基化水平要顯著低于編碼基因;轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSS)及TTS附近lincRNA及編碼基因的甲基化都發(fā)生明顯的降低，但是lincRNA降低的幅度要低于編碼基因。
　　(5)通過(guò)比較三個(gè)豬種之間肝臟的甲基化組，鑒定了261個(gè)lincRNA

7、在三個(gè)豬種之間差異甲基化;然后對(duì)兩兩比較得到的差異甲基化的lincRNA的潛在靶基因的生物學(xué)功能進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)這些差異甲基化的lincRNA的潛在靶基因主要參與轉(zhuǎn)錄、蛋白結(jié)合等生物學(xué)過(guò)程。
　　(6)整合分析lincRNA的啟動(dòng)子甲基化、lincRNA表達(dá)及其潛在靶基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)lincRNA在TSS附近的甲基化水平與其表達(dá)水平存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，且lincRNA的表達(dá)與其靶基因的表達(dá)存在正相關(guān)關(guān)系。
　　(7)通過(guò)利用歐亞家

8、野豬的重測(cè)序數(shù)據(jù)篩選受選擇lincRNA基因，發(fā)現(xiàn)10個(gè)lincRNA在馴化及品種分化過(guò)程中可能受到選擇;結(jié)合差異甲基化和差異表達(dá)的lincRNA及肝臟特異表達(dá)的lincRNA，篩選到一個(gè)可能在馴化或品種分化過(guò)程中對(duì)肝臟代謝起重要作用的lincRNA—XLOC_032274。
　　(8)本研究對(duì)重要的印跡長(zhǎng)鏈非編碼RNA—H19進(jìn)行詳細(xì)的物種間進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)H19在物種間高度保守，且3'端較5'端不保守;分子進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)H19在家