絲裂霉素（MMC）對(duì)大鼠糖耐量影響及其機(jī)理研究.pdf

1、目的：近年來，腫瘤的發(fā)病率明顯升高，而化療即化學(xué)藥物治療作為惡性腫瘤的一種輔助或主要治療手段應(yīng)用也日益廣泛，隨之化療病人也越來越多，化療產(chǎn)生的副作用也越來越受到人們的關(guān)注，近年來，不斷有化療導(dǎo)致血糖異常甚至發(fā)展至糖尿病的臨床報(bào)道，因此，進(jìn)行化療藥物對(duì)動(dòng)物血糖、胰島功能及組織結(jié)構(gòu)的影響的實(shí)驗(yàn)性研究及探討化療誘發(fā)糖尿病的機(jī)制將具有重要意義。 絲裂霉素(Mitomycin,MMC)屬于抗生素類抗腫瘤藥物的一種，屬于周期非特異性藥物，抗

2、腫瘤譜廣，t1/2為1小時(shí)，主要不良反應(yīng)是明顯而持久的骨髓抑制及胃腸道反應(yīng)，偶見心、肝、腎毒性和間質(zhì)性肺炎等。有研究報(bào)道，將大鼠胰島移植物在適當(dāng)濃度的MMC中培育一定時(shí)間后移植到受體大鼠，可以延長(zhǎng)移植物存活時(shí)間，但濃度過大則對(duì)大鼠胰島移植物功能產(chǎn)生抑制作用。目前，尚缺乏MMC對(duì)于大鼠血糖及胰島功能的影響的體內(nèi)研究報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)擬通過靜脈給予大鼠一定劑量的MMC，觀察大鼠血糖、胰島素水平、肝功能及胰腺、肝臟的組織形態(tài)學(xué)改變，探討MMC

3、對(duì)大鼠血糖、胰島功能及胰腺、肝臟組織形態(tài)學(xué)的影響，從而為進(jìn)一步探討化療誘發(fā)糖尿病的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。 方法：健康清潔級(jí)Wistar大鼠(34只)，雄性，6周齡，隨機(jī)分為兩組：對(duì)照組(C組)14只，其中10只用于行經(jīng)腹腔注射葡萄糖耐量試驗(yàn)(Intraperitoneal glucose tolerance test，IPGTT)，4只用于制作組織標(biāo)本；實(shí)驗(yàn)組(T組)20只，其中15只用于行IPGTT,5只用于制作組織標(biāo)本；單籠單

4、只喂養(yǎng)。所有大鼠置于溫度(20±2)℃，濕度55％～65％，光照06:00～18:00，單只單籠，普通飼料喂養(yǎng)(碳水化合物熱卡占60％，脂肪熱卡占11％，蛋白質(zhì)熱卡占29％)，馴化1周后，正常對(duì)照組尾靜脈給予生理鹽水，劑量計(jì)算方法同實(shí)驗(yàn)組；實(shí)驗(yàn)組尾靜脈給予MMC，劑量根據(jù)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)》動(dòng)物給藥劑量計(jì)算方法，按人體(60千克體重)常規(guī)腹腔用藥劑量10mg/次計(jì)算，大鼠用藥量為人體的10倍，公式=10mg÷60Kg×10(mg/Kg大鼠體重

5、)，給藥后第2日(48小時(shí)后)行腹腔內(nèi)葡萄糖耐量試驗(yàn)(IPGTT)，給藥后第3天處死大鼠，留取胰腺、肝臟組織，待行光鏡及電鏡檢測(cè)，處死前取血測(cè)肝功能。 每組大鼠給藥前后均為普通飼料喂養(yǎng)，按60Kcal熱量/只/天，于每日16:00喂，次日10:00收取剩余飼料，自由攝水，每組大鼠均于購(gòu)入時(shí)、打藥前、行IPGTT前稱重。行IPGTT當(dāng)日06：00起禁食，16:00腹腔內(nèi)注入20％葡萄糖，按2.0g/Kg體重葡萄糖計(jì)算，于注入葡萄糖

6、前(0分鐘)及注入葡萄糖后20分鐘，60分鐘，120鐘分別自尾靜脈取血，分離血漿，一部分立即測(cè)血糖，另一部分于-20℃冰箱保存，用于胰島素的測(cè)定。次日結(jié)束試驗(yàn)，留取胰腺及肝臟組織，一部分于4％中性甲醛溶液固定保存，待光鏡檢查，一部分于4％戊二醛溶液固定保存，待電鏡檢查。大鼠處死前內(nèi)眥靜脈采血，分離血清，用于肝功能檢測(cè)。 1. 血糖、胰島素的測(cè)定: 血糖用葡萄糖氧化酶法測(cè)定；胰島素用放射免疫法測(cè)定，采用穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)(Ho

7、meoestasis Model Assessment of Insul in Resistance HOMA-IR，胰島素敏感指數(shù)(Insulin Sensitivitv Index,ISI)評(píng)價(jià)胰島素抵抗的程度。HOMA-IR=(FPGxFlNS)/22.5 ，胰島素敏感指數(shù)ISI=1/(FPG×FINS)(以其自然對(duì)數(shù)來表示)。FPG：Fasting plasma glucose，空腹血糖：FINS：空腹胰島素水平。 2.

8、 肝功能的測(cè)定: 丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)，天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)，γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-GT)采用國(guó)際臨床生化聯(lián)合會(huì)(Intemational Federation of Clinical Chemists，IFCC)推薦方法測(cè)定。 3. 腹腔內(nèi)葡萄糖耐量試驗(yàn)(IPGTT): 大鼠試驗(yàn)結(jié)束前行IPGTT。步驟如下：大鼠自實(shí)驗(yàn)當(dāng)日06:00起禁食，16:00腹腔內(nèi)給予20％葡萄糖溶液，劑量按2.0g葡萄糖/kg體重計(jì)算

9、而來。于注射前(0分)，注射后20分鐘，60分鐘，120分鐘分別自尾靜脈采血0.3～0.4ml,4℃,3000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘，分離血漿，一部分立即測(cè)定血糖，剩余部分于-20 ℃冰箱保存，用于胰島素的測(cè)定。 4. 胰腺及肝臟組織形態(tài)學(xué)檢查: 常規(guī)方法制備大鼠胰腺、肝臟光鏡組織切片，行HE染色，鏡檢；嚴(yán)格按電鏡制作標(biāo)準(zhǔn)切片固定，鏡檢。 5. 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理: 所有數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X

10、±S)表示，組間差異用兩樣本均數(shù)的t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，檢驗(yàn)的顯著性用P值表示。P＜0.05為差異有顯著性。 結(jié)果： 1. 對(duì)體重的影響: 實(shí)驗(yàn)初，大鼠隨機(jī)分組，對(duì)照組體重(140.43±5.62g)，實(shí)驗(yàn)組體重(140.17±7.55g)，P=0.94＞0.05，兩組體重?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差別，具有可比性。打藥前，對(duì)照體重(181.29±28.70g)，試驗(yàn)組體重(181.67±18.53g)，P=0.95＞0.05，差異無顯著性；行

11、IPGTT前，對(duì)照體重(189.14±17.54g)，試驗(yàn)組體重(184.09±14.57g)，P=0.51＞0.05，差異無顯著性。 2. IPGTT后大鼠血糖結(jié)果: 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，實(shí)驗(yàn)組大鼠空腹血糖(6.60±1.37mmol/L)，與對(duì)照組大鼠空腹血糖(6.47±0.64mmol/L)相比。P=0.81＞0.05，差異無顯著性；糖負(fù)荷后20分鐘血糖實(shí)驗(yàn)組(13.14±3.78mmol/L)高于對(duì)照組(9.83±1.71mmo

12、l/L)，P＜0.05，差異有顯著性；糖負(fù)荷后60分鐘實(shí)驗(yàn)組血糖(8.78±1.44mmol/L)高于對(duì)照組(7.42±1.03mmol/L)，P＜0.05，差異有顯著性：糖負(fù)荷后120分鐘實(shí)驗(yàn)組大鼠血糖(7.35±1.26mmol/L)高于對(duì)照組(5.57±0.80mmol/L)，P＜0.01，差異有顯著性。 3. 葡萄糖刺激后的大鼠胰島素水平測(cè)定結(jié)果: 對(duì)照組空腹血漿胰島素水平(11.82±1.59 mIU/L)，血漿胰島素

13、于腹腔注射葡萄糖后20分鐘達(dá)峰值(45.94±10.58mIU/L)，約為基礎(chǔ)值的3.89倍。實(shí)驗(yàn)組空腹血漿胰島素水平(11.75±0.88mIU/L)，與對(duì)照組相比，P＞0.05，于腹腔注射葡萄糖后20分鐘達(dá)峰值(30.54±3.55mIU/L)，明顯低于正常對(duì)照組(P＜0.01)，約為基礎(chǔ)值的2.60倍。糖負(fù)荷后60分鐘血漿胰島素值試驗(yàn)組(21.25±3.17 mIU/L)低于正常對(duì)照組(25.80±3.93 mIU/L)，P＜0.

14、05；120分鐘血漿胰島素值試驗(yàn)組(11.07±1.09mIU/L)與對(duì)照組相比(13.33±2.41 mIU/L)P=0.05,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 4. IPGTT后胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)、胰島素敏感指數(shù)(ISI)結(jié)果: HOMA-IR試驗(yàn)組與對(duì)照組相比(3.99±1.20 vs 3.52±0.36)，P＞0.05，無顯著性差異；ISI試驗(yàn)組(-4.33±0.18)與對(duì)照組(-4.32±0.12)相比，P＞0.05，

15、差異無顯著性。 5. 對(duì)肝功能的影響: 絲裂霉毒對(duì)大鼠肝功能未見明顯影響。 6. IPGTT后血糖曲線下面積: 實(shí)驗(yàn)組在0～120分鐘時(shí)間段曲線下面積(1120.20±220.88)顯著大于對(duì)照組(897.53±102.21)，P＜0.01。 7. 葡萄糖刺激后胰島β細(xì)胞胰島素釋放曲線下面積: 實(shí)驗(yàn)組在0～120分時(shí)間段曲線下面積(2428.5±266.2)顯著低于對(duì)照組(3186.4±466.3)，P＜0.01

16、。 8. 胰腺病理形態(tài)的改變: 實(shí)驗(yàn)組可見胰腺腺泡細(xì)胞輕度腫脹，為細(xì)胞輕度損傷后發(fā)生的早期改變；胰島內(nèi)可見顆粒樣物質(zhì)減少。 9. 肝臟病理形態(tài)的改變: 實(shí)驗(yàn)組可見肝細(xì)胞空泡變性，肝竇充血、擴(kuò)張。 10. 胰腺電鏡下的改變: 實(shí)驗(yàn)組大鼠胰島細(xì)胞內(nèi)線粒體部分或大部分嵴、膜融合，模糊不清或缺失，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度脫顆粒。 11. 肝臟電鏡下的改變: 實(shí)驗(yàn)組大鼠肝臟肝細(xì)胞質(zhì)內(nèi)明顯水腫，細(xì)胞器數(shù)量減少，線粒體大部分

17、嵴、部分膜融合，模糊不清；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆?，F(xiàn)象明顯。 結(jié)論： 1. 靜脈給予大鼠絲裂霉素(MMC)48小時(shí)后大鼠血糖調(diào)節(jié)出現(xiàn)異常，表現(xiàn)在經(jīng)腹腔內(nèi)注射葡萄糖耐量試驗(yàn)后20分鐘、60分鐘、120分鐘血糖均升高。 2. 靜脈給予大鼠絲裂霉素(MMC)48小時(shí)后大鼠胰島素分泌減少，且對(duì)葡萄糖刺激的反應(yīng)能力下降，表現(xiàn)在經(jīng)腹腔注射葡萄糖耐量試驗(yàn)后20分鐘、60分鐘血漿胰島素水平均低于對(duì)照組。 3. 靜脈給予大鼠絲裂霉