自然衰老大鼠糖耐量變化及其機(jī)理的研究.pdf

1、第一部分自然衰老大鼠胰島形態(tài)及胰島素分泌功能特點(diǎn)的觀察 觀察三種不同月齡的SD大鼠與糖脂代謝相關(guān)生化指標(biāo)的變化，了解增齡對(duì)葡萄糖刺激胰島B細(xì)胞胰島素分泌、原位胰島素分泌、胰島形態(tài)的影響，明確衰老相關(guān)胰島B細(xì)胞形態(tài)功能變化的特點(diǎn)。 材料與方法:以6、12、20-24月齡SD大鼠為研究對(duì)象，普通飼料均衡喂養(yǎng)1--2月后，空腹12-14小時(shí)后將三組動(dòng)物行腹腔麻醉，采心血查血糖、血脂、游離脂肪酸水平。然后分別行：1)衰老相關(guān)胰島

2、β細(xì)胞形態(tài)觀察：分離胰腺做HE染色，觀察三組不同年齡動(dòng)物胰島形態(tài)學(xué)變化；用CAST體視學(xué)顯微鏡測(cè)量HE染色切片上單個(gè)胰島的平均體積；用電子顯微鏡觀察老年動(dòng)物胰島β細(xì)胞中的胰島素的分泌顆粒；用胰島素免疫組化原位標(biāo)記胰島β細(xì)胞中胰島素含量，了解在無(wú)葡萄糖刺激時(shí)胰島素的表達(dá)分泌情況。2)衰老相關(guān)胰島β細(xì)胞胰島素分泌功能觀察：分離純化胰島，分別在含5.6mmol/1和16.7mmol/1葡萄糖培養(yǎng)液中靜置培養(yǎng)，于2、4、6、12、24小時(shí)分別采

3、集培養(yǎng)液，用RIA法測(cè)定不同時(shí)間不同月齡動(dòng)物胰島素濃度，了解葡萄糖刺激胰島分泌功能。 結(jié)果：與6月齡和12月齡的SD大鼠相比，20—24月齡大鼠體重、空腹血糖及血脂水平有增高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；12-24月齡動(dòng)物血清中FFA水平顯著增高(386.02±88.08；349.43±93.47 vs.263.93±68.77 mmol/l，p<0.05)；20-24月齡動(dòng)物葡萄糖代謝受損，表現(xiàn)為：1)分離純化的胰島與含5.5mmol/1

4、葡萄糖靜置培養(yǎng)，葡萄糖刺激的胰島素分泌峰值減少(6.4±2.7 vs.13.97±1.23(6月)&12.08±0.76(12月)mU/1/30islets)，時(shí)間延遲(6h vs.2h)；與含16.7mmol/1葡萄糖培養(yǎng)24小時(shí)分泌總量明顯少于6月齡動(dòng)物(3.51±2.07 vs.11.17±0.71 mU/1/30islets，P<0.05)。2)老齡鼠胰島B細(xì)胞占胰島面積的比例較大(72.99±29.65％vs.67.76±23

5、.48％(12月)&61.69±30.12％(6月))，但無(wú)顯著性差異； 3)胰島內(nèi)胰島素抗體免疫組化陽(yáng)染面積顯著減少(19.81±8.56 vs.20.41±10.7(6月)&24.56±12.3(12月)×10<'4> μ m<'2>/切片，P<0.05)，平均光密度值隨著動(dòng)物年齡的增加而降低(242.71±95.37(24月齡)，309±83.99(12月齡)vs.558±69.94(6月齡)，P<0.05)。以上發(fā)現(xiàn)說(shuō)明老年鼠在

6、空腹血糖正常時(shí)即已具備胰島素抵抗的某些特征：如血FFA增高。對(duì)葡萄糖刺激出現(xiàn)峰值降低、達(dá)峰時(shí)間延遲的特點(diǎn)：另外雖然胰島面積在胰腺中比例有減少的趨勢(shì)，然而β細(xì)胞在胰島的比例卻略有增加，但細(xì)胞內(nèi)胰島素分泌量減少。 這些研究結(jié)果提示老年人胰島β細(xì)胞雖然增生，體積增大，但β細(xì)胞基礎(chǔ)和對(duì)葡萄糖刺激的胰島素分泌功能減低。說(shuō)明一旦衰老糖代謝受損出現(xiàn)糖尿病，應(yīng)盡早考慮胰島素治療同時(shí)改善胰島素抵抗。 第二部分老齡大鼠胰島β細(xì)胞自吞噬現(xiàn)象觀

7、察 目的:通過(guò)觀察老年動(dòng)物胰島β細(xì)胞中兩種細(xì)胞程序性死亡方式即；自體吞噬和細(xì)胞凋亡，初步了解二者和衰老的胰島β細(xì)胞分泌功能受損的關(guān)系。 材料與方法:將3種不同月齡SD動(dòng)物(6、12、24月齡)均衡膳食1--2月后，空腹12--14小時(shí)，腹腔麻醉，迅速分離胰腺，固定、包埋后切片，通過(guò)透視電鏡對(duì)自體吞噬與調(diào)亡兩種細(xì)胞程序性死亡方式進(jìn)行觀察，并用Tunel法對(duì)三組動(dòng)物胰島β細(xì)胞進(jìn)行免疫組化染色，用平均光密度值半定量分析。

8、 結(jié)果：通過(guò)透視電鏡，在20月齡動(dòng)物胰島β細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)大量形態(tài)各異的自噬小體；同時(shí)發(fā)現(xiàn)老年鼠胰島β細(xì)胞胞漿中大量腫脹、空泡變性的線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。在12月齡動(dòng)物胰島β細(xì)胞內(nèi)僅見(jiàn)到初級(jí)溶酶體，其內(nèi)未見(jiàn)吞噬細(xì)胞器。6月齡動(dòng)物胰島β細(xì)胞內(nèi)則無(wú)類(lèi)似發(fā)現(xiàn)。無(wú)論電鏡或Tunel法免疫組化染色均未觀察到凋亡。 結(jié)論與解釋:觀察發(fā)現(xiàn)衰老動(dòng)物胰島β細(xì)胞中存在自吞噬的激活，但未見(jiàn)凋亡性細(xì)胞死亡。與本課題組前期的結(jié)果進(jìn)行比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，衰老對(duì)β細(xì)胞的影響與

9、高脂高糖誘導(dǎo)糖尿病大鼠中β細(xì)胞的改變有明顯區(qū)別：后者存在兩種死亡方式，而前者僅表現(xiàn)為自體吞噬作用的激活增強(qiáng)。推測(cè)衰老個(gè)體胰島β細(xì)胞中激活的自吞噬可能與線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹及變性有關(guān)，是細(xì)胞內(nèi)能量代謝障礙的結(jié)果，可能是導(dǎo)致增齡相關(guān)β細(xì)胞胰島素分泌功能障礙的機(jī)制之一。進(jìn)一步量化自體吞噬可能有助于闡明兩者的關(guān)系。 第三部分自然衰老SD大鼠胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的研究 背景與目的:胰島素通過(guò)胰島素/胰島素受體途徑介導(dǎo)胰島素相關(guān)葡萄糖代

10、謝并通過(guò)胰島素/胰島素樣生長(zhǎng)因子--1與衰老相關(guān)，兩者均可以通過(guò)P13K途徑影響絲氨酸/蘇氨酸激酶蛋白激酶B(PKB，Akt)的表達(dá)。通過(guò)測(cè)定磷酸化Akt(p-Akt)在肝臟和骨骼肌中的表達(dá)，初步探討機(jī)體老化和葡萄糖代謝受損的機(jī)制。 材料與方法:將3種不同月齡SD動(dòng)物(6、12、24月齡)均衡膳食1--2月后，空腹12—14小時(shí)，腹腔麻醉，迅速分離胰腺、肝臟、骨骼肌，固定、包埋后切片應(yīng)用免疫組化技術(shù)觀察IRS-1與p-Akt在不

11、同月齡大鼠胰腺、肝臟和骨骼肌中的表達(dá)，并MOD值半定量測(cè)定相關(guān)蛋白的表達(dá)。 結(jié)果：1)IRS-1在三組動(dòng)物三種組織中均有表達(dá)。用MOD值定量分析發(fā)現(xiàn)與其它月齡大鼠相比，20--24月齡的大鼠無(wú)論胰島(240.70±77.14vs.266.92±54.92(12mon.)&360.73±23.89(6mon.))、肝臟(3905.09±579.04 vs.4045.60±974.79(12mon.)&5004.71±552.70(

12、6mon.))或骨骼肌(1571.07±748.50 Vs.1605.80±829.60(12mon.)&2356.80±875.85(6mon.))均表現(xiàn)為IRS-1的表達(dá)減少，但無(wú)顯著性差異(P>0.05)：2)老年鼠p-Akt在肝細(xì)胞中的表達(dá)顯著減少(2911.06±268.13 vs.4683.72±582.29(12mon.)&4903.06±688.44(6mon.)，P<0.05)，而在骨骼肌細(xì)胞中，三組動(dòng)物p-Akt的表