淫羊藿苷治療亞急性衰老大鼠睪丸功能減退的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景與目的：中老年男子雄激素部分缺乏綜合癥(Partial Androgen Deficiency In The Aging Male, PADAM)是在增齡過(guò)程中,由于生殖內(nèi)分泌衰老而出現(xiàn)的性欲低下、記憶力減退、認(rèn)知功能降低、抑郁、易怒、疲乏、骨質(zhì)密度下降、脂代謝紊亂等類似于性腺機(jī)能低下的癥狀,其重要原因是雄激素部分缺乏。目前睪酮補(bǔ)充治療(Testosterone Supplementation Therapy,TST)雖然在某些方面

2、具有一定的療效,但在劑量、療程和副作用等方面爭(zhēng)議仍較大。淫羊藿苷是補(bǔ)腎壯陽(yáng)之要藥,具有抗衰老,調(diào)節(jié)生殖內(nèi)分泌之功效。本實(shí)驗(yàn)采用 D-半乳糖致亞急性衰老大鼠模型,觀察淫羊藿苷及睪酮對(duì)衰老大鼠血清 SOD活性、T、E2含量,睪丸組織形態(tài)學(xué)變化和睪丸組織一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)和間質(zhì)細(xì)胞iNOS蛋白、衰老基因P16蛋白表達(dá)、睪丸生殖細(xì)胞凋亡的影響,探討亞急性衰老大鼠睪丸功能減退的機(jī)理,評(píng)估該模型作為PADAM模型的可行性;探討

3、淫羊藿苷對(duì)生殖腺衰老作用機(jī)理,為臨床治療PADAM提供理論依據(jù)。
　　材料與方法：48只3月齡雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(Control,C)、模型對(duì)照組(Model,M)、淫羊藿苷組(,ICA)、十一酸睪酮(testosterone undecanoate,TU)組。C組每天注射生理鹽水2ml,其余3組每天按200mg/kg體重腹腔注射D-半乳糖連續(xù)6周,建立亞急性衰老動(dòng)物模型。第7周開(kāi)始,C、M組給予生理鹽水2ml灌胃,I

4、CA組每天按100mg-1kg.d-1體重灌服淫羊藿,TU組按50mg/kg給予肌注一次TU后處理同C、M組,連續(xù)給藥兩周。于第8周末用戊巴比妥鈉(40mg/kg)麻醉后,右心房穿刺采血3-5ml;取睪丸固定,常規(guī)石蠟包埋,制作2um厚的連續(xù)切片。HE染色觀察睪丸組織變化,SP法觀察睪丸組織P16蛋白表達(dá)情況,SABC法觀察間質(zhì)細(xì)胞iNOS蛋白表達(dá)情況,TUNEL法檢測(cè)睪丸生殖細(xì)胞凋亡情況。化學(xué)比色法檢測(cè)TNOS、iNOS活性;采用硝酸

5、酶還原法檢測(cè)NO濃度。SOD用ELISA法檢測(cè),T及E2用放射免疫法檢測(cè)。
　　結(jié)果：①動(dòng)物一般情況及HE染色結(jié)果:模型組大鼠出現(xiàn)活動(dòng)減少,毛發(fā)逐漸枯黃,且褪毛嚴(yán)重等衰老特征。HE染色顯示睪丸組織出現(xiàn)退行性變化;淫羊藿苷和睪酮治療后,大鼠活動(dòng)增加,褪毛等衰老癥狀和睪丸組織的退行性變化顯著改善。②血清SOD、睪酮及雌激素:模型組血清SOD活性、T濃度均較正常對(duì)照組顯著下降(p<0.01,p<0.01)。與模型組比較,淫羊藿苷組和TU

6、組血清SOD活性、T濃度均顯著升高(p<0.05,p<0.01),而各組E2濃度變化無(wú)顯著意義(p>0.05)③睪丸TNOS、iNOS活性及NO濃度的變化:模型組睪丸組織NO濃度、TNOS、iNOS活性比正常對(duì)照組均顯著增加(p<0.01),淫羊藿苷治療可以明顯降低睪丸TNOS、iNOS活性及NO濃度,與模型組比較差異顯著(p<0.01);睪酮治療組睪丸TNOS、iNOS活性及NO濃度的降低沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。④睪丸內(nèi)iNO

7、S蛋白表達(dá)結(jié)果:iNOS主要表達(dá)于睪丸間質(zhì)細(xì)胞,模型組呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá),陽(yáng)性率較正常組顯著增加(p<0.01);睪酮治療組陽(yáng)性率下降無(wú)顯著意義(p>0.05);淫羊藿苷治療組陽(yáng)性率較模型組顯著下降(p<0.01)。⑤睪丸內(nèi)P16蛋白表達(dá)結(jié)果:正常組大鼠睪丸組織P16主要在精原細(xì)胞和精子核內(nèi)表達(dá),間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)很少;模型組P16陽(yáng)性率較正常組顯著升高(p<0.01),主要表現(xiàn)為間質(zhì)細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)明顯增多;淫羊藿苷治療組P16陽(yáng)性細(xì)胞百分率較模型組

8、顯著下降(p<0.01);睪酮組P16陽(yáng)性細(xì)胞百分率與模型組比較,差異無(wú)顯著意義(p>0.05)。⑥睪丸生殖細(xì)胞凋亡結(jié)果:正常組大鼠生殖細(xì)胞凋亡較少,細(xì)胞凋亡以精母細(xì)胞為主,間質(zhì)細(xì)胞凋亡少見(jiàn);模型組生殖細(xì)胞凋亡率較正常組明顯增高(p<0.01),間質(zhì)細(xì)胞凋亡明顯增多;與模型組比較,淫羊藿組和睪酮組生殖細(xì)胞凋亡均明顯減少(p<0.01,p<0.05)。⑦相關(guān)分析結(jié)果:亞急性衰老大鼠生殖細(xì)胞凋亡率與P16蛋白表達(dá)陽(yáng)性率(r=0.736,p<

9、0.01)、血清NO濃度(r=0.6,p<0.01)、iNOS酶活性(r=0.572,p<0.01)、TNOS酶活性(r=0.5586,p<0.01)、iNOS蛋白陽(yáng)性率(r=0.724,p<0.01)均呈正相關(guān);凋亡率與超氧化物歧化酶(SOD)活性(r=-0.572,p<0.01)呈負(fù)相關(guān);衰老基因P16蛋白表達(dá)與血清NO濃度(r=0.722,p<0.01)、iNOS酶活性(r=0.661,p<0.01)、TNOS酶活性(r=0.66

10、8,p<0.01)、iNOS蛋白陽(yáng)性率均呈正相關(guān)(r=0.846,p<0.01);與超氧化物歧化酶(SOD)活性(r=-0.501,p<0.01)呈負(fù)相關(guān)。
　　結(jié)論：①亞急性衰老雄性大鼠睪丸組織出現(xiàn)退行性變化,雄激素水平下降,抗氧化能力減弱;生殖細(xì)胞尤其是間質(zhì)細(xì)胞衰老和凋亡增多,生殖細(xì)胞的凋亡和衰老與睪丸組織內(nèi)的iNOS活性增加及抗氧化能力降低相關(guān),該模型做為研究性腺衰老與篩選抗衰老藥物的動(dòng)物模型具有一定的可行性。②淫羊藿苷和睪