豬傳染性胃腸炎病毒蛋白激活TLRs對(duì)PK-15細(xì)胞FcRn表達(dá)影響的研究.pdf

1、免疫系統(tǒng)是機(jī)體在進(jìn)化過(guò)程中形成的一種可以通過(guò)多種屏障來(lái)識(shí)別“自己”和“非己”的系統(tǒng)。黏膜免疫是抵抗外源入侵的第一道屏障。當(dāng)“非己”成分入侵機(jī)體后可以被機(jī)體的模式識(shí)別受體(PRRs)所識(shí)別，并引起信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而促進(jìn)某些核轉(zhuǎn)錄因子的激活并入核進(jìn)而調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)。其中第一個(gè)被確認(rèn)的模式識(shí)別受體就是TLRs家族。
　　本研究一方面通過(guò)構(gòu)建TGEV結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白真核表達(dá)載體研究其對(duì)細(xì)胞FcRn表達(dá)的影響，并挖掘病毒相關(guān)蛋白的功能域

2、;另一方面研究TGEV、UV-TGEV以及TGEV蛋白引起細(xì)胞FcRn表達(dá)上調(diào)的相關(guān)TLRs信號(hào)通路。取得的主要研究成果如下:
　　1.TGEV對(duì)細(xì)胞FcRn表達(dá)的影響
　　TGEV感染PK-15細(xì)胞或IPEC-J2細(xì)胞后，通過(guò)熒光定量PCR、雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)以及Western Blot實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞FcRn的mRNA和蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明TGEV能引起細(xì)胞FcRn mRNA和蛋白表達(dá)顯著上調(diào)。
　　2.TGEV蛋

3、白對(duì)細(xì)胞FcRn表達(dá)的影響
　　本研究通過(guò)紫外線滅活TGEV，并用不同劑量的UV-TGEV刺激PK-15細(xì)胞后通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)和Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)UV-TGEV能夠顯著上調(diào)FcRn mRNA和蛋白表達(dá)水平。說(shuō)明TGEV的結(jié)構(gòu)蛋白參與了細(xì)胞FcRn表達(dá)的調(diào)控。與TGEV活病毒刺激相比，UV-TGEV上調(diào)細(xì)胞FcRn程度較低，這說(shuō)明除病毒核酸以外，TGEV的非結(jié)構(gòu)蛋白也可能參與了對(duì)FcRn的表達(dá)調(diào)控。
　　3

4、.TGEV蛋白真核表達(dá)載體的構(gòu)建
　　本研究通過(guò)提取TGEVWH-1株的RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，并以此為模板，應(yīng)用TGEV各蛋白基因的特異性引物分別進(jìn)行擴(kuò)增，并將擴(kuò)增產(chǎn)物回收后經(jīng)酶切連接到pCAGGS-HA真核表達(dá)載體，通過(guò)PCR擴(kuò)增、酶切鑒定及測(cè)序驗(yàn)證準(zhǔn)確后，再分別將各蛋白重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞。通過(guò)熒光定量PCR和Western Blot檢測(cè)FcRn的表達(dá)水平。結(jié)果表明結(jié)構(gòu)蛋白M、N和E以及非結(jié)構(gòu)蛋白nsp1、ns

5、p5、nsp7、nsp8、nsp9、nsp15均可以上調(diào)細(xì)胞FcRn的表達(dá)。
　　4.TGEV M和N蛋白截短表達(dá)載體的構(gòu)建
　　為了探究M蛋白和N蛋白調(diào)控FcRn表達(dá)的結(jié)構(gòu)功能域，本研究通過(guò)構(gòu)建不同的截短蛋白表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，通過(guò)Western Blot和熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞FcRn表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。最終確定N蛋白有效功能域位于156-198位氨基酸，M蛋白有效功能域位于219-262位氨基酸。
　　

6、5.探究TGEV上調(diào)FcRn表達(dá)的相關(guān)TLRs信號(hào)通路
　　本研究對(duì)TGEV、UV-TGEV以及TGEV蛋白上調(diào)細(xì)胞FcRn的表達(dá)是否通過(guò)激活TLRs相關(guān)通路進(jìn)行調(diào)控展開(kāi)了研究。首先將MyD88和TRIF負(fù)調(diào)控質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，再應(yīng)用TGEV和UV-TGEV刺激細(xì)胞，然后通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞FcRn表達(dá)水平的變化，證實(shí)了TGEV和UV-TGEV均能通過(guò)TLRs通路上調(diào)細(xì)胞FcRn蛋白的表達(dá);通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)證實(shí)了TGEV感染細(xì)

7、胞能夠激活TLR1、TLR2、TLR3、TLR4和TLR6的表達(dá)，UV-TGEV能夠激活TLR1和TLR2。進(jìn)一步將能上調(diào)FcRn表達(dá)的各種TGEV蛋白表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)nsp1、nsp5、nsp7、nsp8、nsp9、nsp15等六種非結(jié)構(gòu)蛋白后均能顯著激活TLR1、TLR2、TLR4和TLR6，結(jié)構(gòu)蛋白E能顯著激活TLR2、TLR4和TLR6，截短蛋白N1能顯著激活TLR1、TLR4和TLR6，截短蛋白M2能激活TLR2和T