水通道蛋白3在人體多種器官正常和癌組織中的表達(dá)及意義.pdf

1、本文對(duì)人肺臟正常和癌組織、及其癌細(xì)胞株中AQP3的表達(dá)情況進(jìn)行研究，并分析與臨床病理因素的關(guān)系，以探討其在正常肺組織的生物學(xué)意義以及在肺癌發(fā)展中的意義。此外，對(duì)全身多種腺癌及癌旁組織中．AQP3的表達(dá)情況進(jìn)行研究，探討其在轉(zhuǎn)移癌組織來(lái)源鑒別中的意義和臨床應(yīng)用前景。 實(shí)驗(yàn)材料與方法： 1.標(biāo)本來(lái)源：159例肺癌及其癌旁組織標(biāo)本包括84例腺癌、42例鱗癌、10例小細(xì)胞癌、15例大細(xì)胞癌、4例多形性癌和4例肺轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌，以及

2、86例全身其他組織腺癌及其癌旁組織標(biāo)本包括15例結(jié)腸腺癌、5例胃腺癌、5例前列腺癌、35例乳腺癌、11例子宮內(nèi)膜腺癌、10例卵巢癌及5例甲狀腺癌，均來(lái)自日本山梨大學(xué)附屬醫(yī)院和甲府市立醫(yī)院外科手術(shù)標(biāo)本。標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)10％中性緩沖福爾馬林固定、石蠟包埋。按WHO 2001年出版的《肺組織腫瘤學(xué)分類第7版》標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷分類。6例新鮮肺腺癌及癌旁正常肺組織來(lái)自山梨大學(xué)附屬醫(yī)院胸外科2004年10月～2005年4月手術(shù)切除標(biāo)本。 2.免疫

3、組織化學(xué)和免疫熒光染色：免疫組織化學(xué)染色采用EnVision兩步法。一抗使用群馬大學(xué)高田邦昭教授饋贈(zèng)的兔抗大鼠/人AQP3多克隆抗體，工作濃度為1∶500。標(biāo)本進(jìn)行10分鐘高壓熱修復(fù)后，一抗4°C過(guò)夜孵育，其他步驟按常規(guī)進(jìn)行。間接免疫熒光步驟按常規(guī)進(jìn)行。一抗同前，二抗使用FITC標(biāo)記的豬抗兔IgG。陰性對(duì)照以PBS代替一抗，陽(yáng)性對(duì)照使用AQP3陽(yáng)性的正常腎組織切片。對(duì)部分可疑病例進(jìn)行了重復(fù)染色。結(jié)果判定： AQP3蛋白表達(dá)定位于細(xì)胞膜，

4、染色陽(yáng)性為細(xì)胞膜呈棕黃色。按陽(yáng)性細(xì)胞百分率記分：一，陰性；1+，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)小于腫瘤細(xì)胞總數(shù)的25％；2+，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占腫瘤細(xì)胞總數(shù)的26-50％；3+，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占腫瘤細(xì)胞總數(shù)的51-75％；4+，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)大于腫瘤細(xì)胞總數(shù)的75％。 3.Western blot：檢測(cè)AQP3在正常肺組織和肺癌組織中的表達(dá)。取0.1 cm<'2>左右的新鮮組織塊，加入1ml RIPA裂解液，勻漿，蛋白定量。將含40μg總蛋白的組織裂解產(chǎn)物溶解到

5、上樣緩沖液中，70°處理10分鐘。進(jìn)行13％的SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)到PVDF膜上。用5％脫脂奶粉封1小時(shí)后，于1∶2000的抗AQP3抗體中4°過(guò)夜。膜經(jīng)TBS洗2次后，在1∶2,000的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗中孵育1小時(shí)。 TBS洗2次后，進(jìn)行ECL顯色。結(jié)果判定為轉(zhuǎn)印膜上出現(xiàn)藍(lán)紫色蛋白條帶，用NIH圖像分析系統(tǒng)測(cè)定各條帶吸光度值，分析灰度值。 4.總RNA提取和RT-PCR：使用Isogen試劑對(duì)肺癌冰

6、凍及石蠟組織、細(xì)胞株進(jìn)行常規(guī)總RNA提取后，測(cè)定OD值確定RNA濃度，1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量。RT-PCR按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。PCR程序?yàn)?4°C 8分；94°C 30分鐘變性-57°C1分鐘退火-72°C 30秒延伸，35個(gè)周期；72°C 10分。引物序列如下：AQP3 forward 5`-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3`-reverse 5`-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3`-(180bp)

7、，GAPDH forward 5`-ATCAA CCTGGCCTTTGGCTT-3`、reverse 5`-TATTCCAGCACCCAAGAAGGCTT-3`(226bp)。 5.細(xì)胞培養(yǎng)：1例肺腺癌細(xì)胞株(A549)和1例肺鱗癌細(xì)胞株(Sq-1)均來(lái)自日本東北大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心。用含青霉素G(100U/ml)、鏈霉素(100mg/ml)、10％胎牛血清的RMPI 1640培養(yǎng)基5％C02、37℃下常規(guī)培養(yǎng)。

8、6．統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)分析軟件行X<'2>檢驗(yàn)，P<0.05設(shè)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1．AQP3在正常肺組織中的表達(dá)：在支氣管假?gòu)?fù)層上皮中，AQP3強(qiáng)表達(dá)于基底細(xì)胞膜，弱或無(wú)表達(dá)于柱狀纖毛細(xì)胞或杯狀細(xì)胞膜，部分表達(dá)于支氣管粘液腺分泌細(xì)胞膜。在細(xì)支氣管中，AQP3中度表達(dá)于上皮全層。在肺泡組織，AQP3特異性表達(dá)于肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞膜。 2.在肺癌組織中，免疫組化結(jié)果顯示：AQP3在47.8

9、％(76/159)的肺癌組織中陽(yáng)性表達(dá)，其中腺癌陽(yáng)性率達(dá)70.2％(59/84)，鱗癌與大細(xì)胞癌較低，分別為35.8％(15/42)和13.4％(2/15)，在小細(xì)胞癌(0/10)、多形性癌(0/4)和肺轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌(0/4．)中均無(wú)表達(dá)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，肺癌組織學(xué)類型之間、肺腺癌與其它各類肺癌的AQP3陽(yáng)性率均有顯著性差異(P<0.05)。 3.在肺腺癌組織中，AQP3的陽(yáng)性率分別為：支氣管肺泡型100％(12/12)、乳頭狀

10、型82.1％(32/39)、腺泡樣型52.9％(9/17)及伴粘液產(chǎn)生的實(shí)性型25.0％(4/16)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，肺腺癌組織學(xué)亞型之間、支氣管肺泡癌與腺泡樣腺癌、支氣管肺泡癌與伴粘液產(chǎn)生的實(shí)性腺癌、以及乳頭狀腺癌與伴粘液產(chǎn)生的實(shí)性腺癌之間的AOP3陽(yáng)性率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。 4.臨床病理學(xué)分析表明：肺腺癌中AQP3的陽(yáng)性率與腫瘤分化程度呈正相關(guān)，與腫瘤臨床分期呈負(fù)相關(guān)(P<0.01)。 5．Western

11、Blot和RT-PCR分析進(jìn)一步證實(shí)了肺癌細(xì)胞株和肺癌組織中AQP3蛋白及其mRNA的表達(dá)。 6.對(duì)胃、結(jié)腸、乳腺、前列腺、子宮、卵巢、甲狀腺等七種器官的腺癌及癌旁組織中．AQP3的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，正常及其腺癌組織的．AQP3陽(yáng)性率分別為：前列腺均為100％(5/5)，乳腺為75.0％(6/8)和14.3％(5/35)，胃腺為60％(3/5)和80.0％(4/5)，子宮內(nèi)膜為14.3％(3/21)和27.2％(3/11)，結(jié)腸

12、為37.5％(3/8)和20.0％(3/15)，卵巢及甲狀腺均為0(分別為0/3、0/10和0/5、0/5)。 研究結(jié)論： 1.AQP3廣泛分布于呼吸道，參與正常肺組織的水及物質(zhì)代謝。 2.AQP3的表達(dá)在不同肺癌組織學(xué)類型中有顯著差異。其中，腺癌最多，鱗癌次之，大細(xì)胞癌最少，小細(xì)胞癌、多形性癌和肺轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌中無(wú)表達(dá)。在肺腺癌組織學(xué)亞型中，支氣管肺泡癌最多。 3.肺腺癌的臨床病理學(xué)分析表明，AQP3的陽(yáng)